Famesyl protein transferase involved in the first step of post-translational modification of $p21^{ras}$ proteins transfers the famesyl moiety from famesyl pyrophosphate to a cysteine residue in $p21^{ras}$ proteins. The enzyme was first purified 30,000-fold from bovine testis by use of 30~50% ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephacel ion exchange chromatography, Sephacryl S-300 gel filtration chromatography, Sephacryl S-200 gel filtration chromatography, and hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met) affinity chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be ~100 kDa by gel filtration and SDS-polyacrylamide gels showed two closely spaced bands of ~50 kDa protein. These indicate that the enzyme consists of two nonidentical subunits, a and 13, which have slightly different molecular weights. The enzyme was inhibited by hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met), which acted as an alternative substrate that competed for famesylation. Kinetic analysis by measuring initial velocities showed that famesyl protein transferase is a very slow enzyme. EDTA-treated famesyl protein transferase showed little activity with $Mg^{2+}$ or $Zn^{2+}$ alone, but required both $Mg^{2+}$ and $Zn^{2+}$ for the catalytic activity.
A novel process for urokinase purification was studied using p-aminobenzamidine as the ligand and sepharose 4B as the matrix. The adsorption, washing, and elution conditions were optimized by an unusual method. An adsorption buffer containing 2.5 M NaCl and $1\%$ Tween 80 facilitated the adsorption of urokinase on the affinity media and prevented contaminants from binding to the p-aminobenzamidine affinity gel. It was found that $5\%$ Tween 80 removed most of the contaminants from the affinity column. A 0.2 M glycine elution buffer containing 0.5 M NaCl (pH 3.0) was found to have a strong elution ability with a high recovery and purity of urokinase. A crude urokinase material of231 IU/mg protein from human urine was purified to 124,300 IU/mg protein with a purification factor of 538 and yield of $86.7\%$. As a result, a high purity urokinase was obtained with only a single affinity chromatography step. The purification process was successfully scaled-up to a 2-1 chromatography column. The resulting urokinase eluate could be directly lyophilized, thereby complying with Chinese pharmacopoeia (1995 version) standards.
환자의 복수와 늑막액으로부터 p-diazonium phenylphosphorylcholine(DPPC) coupled Separose-4B affinity chromatography와 hydroxylapatite chromatography를 실시하여 C-reactive protein (CRP)를 분리, 정제하였다. 정제된 CRP를 토끼에게 면역화하여 항혈청을 얻고 affinity chromatography를 하여 면역항체(IgG)를 분리하였다. 분리된 면역항체를 미립자에 감작시킨 후 미립자 응집반응에 의하여 3분내에 CRP를 측정할 수 있는 간이 면역 측정법을 개발하였다. 본 연구에서 개발된 CRP측정법의 검출범위는 0.5~20mg/㎗이며, 임상 시험 결과 0.7~2.9mg/㎗에서는 강한 응집 반응을, 5.O~l3.2mg/㎗에서는 약한 응집반응을 보였고 28mg/dl이상에서는 항원 과잉으로 인한(zone of Ag excess phenomenon) 위음성을 나타냈다. 74명의 환자 혈청을 대상으로 CRP의 농도를 조사한 결과 평균치는 3.8mg/dl이었으며 대부분의 환자에서는 10mg/dl 이하의 농도로 존재하였다. 그러므로 1차 판정시 음성을 나타낸 시료라도 혈청을 5~10배정도 희석하여 재분석한다면 오차없이 CRP 를 검출할 수 있었다. 환자 혈청을 검체로 하여 본 연구에서 개발한 면역측정법과 현재 수입 시판 중인 프랑스의 B사 제품과 일본의 I사 제품을 비교한 결과 좋은 상관관계를 보였다. 이와 같은 평가 분석을 통하여 볼 때 본 연구에서 개발한 간이 면역 측정법은 사용이 비교적 간편하며 신빙성이 있어 CRP를 스크리닝하는데 효과적임을 알 수 있었다.
The production of Streptomyces griseus trypsin (SGT) by S. griseus IFO13350 transformed with the expression vector pWHM3-TR1R2, containing sprT encoding SGT and the two positive regulatory genes sgtR1 and sgtR2, was investigated in various media. Cultivation in Ferm-0 gave 1.4 times more trypsin activity than in C5/L medium. In addition, replacement of 2% glucose and 1% skim milk in Ferm-0 with 2% dextrin and 1% tryptone (designated Ferm-II) enhanced trypsin activity 4.1-fold. To simplify the purification process, the supernatant from the S. griseus transformant cultured in Ferm-II medium was fractionated with ammonium sulfate (25-55%), then subjected to Hitrap Benzamidine FF affinity column chromatography. The specific activity of SGT purified by one-step chromatography was 69,550 unit/mg protein and the overall purification yield was above 8%, indicating that this method is more effective than those previously reported. Purified SGT was most active at pH 8.0 and $50^{\circ}C$, and it maintained activity between pH 7.0 and 9.0 and at temperatures up to $70^{\circ}C$. These enzymatic properties are very similar to those of authentic eukaryotic trypsin purified from bovine pancreas.
우유 casein단백질을 alcalase로 가수분해시켰을 때, 생성되는 peptide 중 철분과 결합력이 있는 peptide인 IBP가 $immobilized\;Fe^{3+}\;affinity\;chromatography$에 의하여 용이하게 분리되었다. IBP의 분자량은 2,175 dalton이었으며 $pH\;6,\;37^{\circ}C$에서 1시간동안 일정량의 철분과 항온처리하였을 경우, 25, 50, 100 g/mL의 IBP는 각각 4.2, 5.7, 7.1 g의 철분을 가용화시키는 능력을 보였다. IBP는 proline (24.5 Mol%), lysine (15.7 Mol%), glutamic 또는 glutamine (14.9 Mol%) 등의 아미노산으로 구성되어 있었으며 이들의 N-terminal sequence는Met-Ala-Pro-Lys-His의 순으로 이루어져 있었다. 분자량, 아미산 조성, N-terminal sequence등의 결과를 종합해 보면 IBP는 casein 중 -casein의 아미노산 서열 $102{\sim}119$에 해당하는 18개의 아미노산으로 구성된 peptide임을 알 수 있었다.
Acetolactate synthase was purified from Escherichia coli MF2000/pTATX containing Arabidopsis thaliana acetolactate synthase gene. Purification steps included DEAE cellulose ion exchange column chromatography, phenyl sepharose hydrophobic column chromatography, hydroxylapatite affinity column chromatography, and Mono-Q HPLC. Molecular weight was estimated to be ∼65 KDa and purification fold was 109 times. The enzyme showed a pH optimum of 7 and the $K_M$ value was 5.9 mM. The purified enzyme was not inhibited by any of the end products, valine, leucine, and isoleucine.
본 연구는 Debaryomyces sp.가 생산하는 ${\alpha}-galactosidase$의 mannobiose-sepharose 담체합성법에 의한 affinity column chromatography를 수행하여 효소정제, 효소 화학적 성질 및 galactosyl mannooligosacchrides에 대한 기질특이성 규명을 주요 목적으로 하였다. 배양시간별 활성과 pH의 변화에서 배양시간 40시간부터 활성이 증가하고 있으며, 70시간에서 25.8unit/ml의 최대활성을 나타내고 있으며, 배양초기 pH 6.0에서 시작되어 배양말기에는 pH 8을 나타내는 pH의 변화를 보였다. 최적 pH는 4.0, 최적온도는 $60^{\circ}C$이며 $pH\;3{\sim}4.5$에서 100%의 잔존활성을 나타낸 반면 pH 8.0에서는 20%로 급격히 감소하였고. 온도안정성에서 $30{\sim}50^{\circ}C$에서는 100%의 잔존활성을 나타내었으나 $70^{\circ}C$ 이상에서는 20% 이하의 잔존활성을 나타내었다. $Hg^{2+}$에 의해서 54%, $Ag^{2+}$에 의해서는 85%로 저해되었으며, 그 이외의 이온에 대해서는 큰 영향을 받지 않았다. Debaryomyces sp.유래 ${\alpha}-galactosidase$는 24시간 반응 후 melibiose, $Gal^3Man_3$를 완전 가수분해 하여 각각 galactose와 glucose, galactose와 mannotriose로 분해되었으나 $Gal^3Man_4$에 대해서는 12시간 반응시켜도 기질로부터 galactose 유리가 불가능함이 확인되었다.
Paper Chromatography 법(法)으로 아미노산류(酸類)와 이노신산(酸) 및 수은중독(水銀中毒) 치료제(治療劑)인 BAL의 수은(水銀)에 대(對)한 친화력(親和力)의 크기를 비교(比較)하였다. 그 결과(結果) Cysteine Cystine 및 Methionine의 3종(種)의 합류황(合硫黃) 아미노산(酸)은 수은(水銀)과 쉽게 결합(結合)하였으나 다른 아미노산(酸)들과의 결합(結合)은 확인(確認)하지 못하였다. 수은(水銀)은 SH기(基)를 가지는 Sodium thiosulfate 및 BAL과는 쉽게 결합(結合)하였으며 이노신산(酸)과도 쉽게 결합(結合)하였다. 이들 함류황(含硫黃) 아미노산(酸) 류(類)보다 큰 것으로 판단(判斷)되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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