• 제목/요약/키워드: Affinity chromatography

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Purification and Characterization of Farnesyl Protein Transferase from Bovine Testis

  • Ryo, Kwon-Yul;Baik, Young-Jin;Yang, Chul-Hak
    • BMB Reports
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    • 제28권3호
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    • pp.197-203
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    • 1995
  • Famesyl protein transferase involved in the first step of post-translational modification of $p21^{ras}$ proteins transfers the famesyl moiety from famesyl pyrophosphate to a cysteine residue in $p21^{ras}$ proteins. The enzyme was first purified 30,000-fold from bovine testis by use of 30~50% ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephacel ion exchange chromatography, Sephacryl S-300 gel filtration chromatography, Sephacryl S-200 gel filtration chromatography, and hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met) affinity chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be ~100 kDa by gel filtration and SDS-polyacrylamide gels showed two closely spaced bands of ~50 kDa protein. These indicate that the enzyme consists of two nonidentical subunits, a and 13, which have slightly different molecular weights. The enzyme was inhibited by hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met), which acted as an alternative substrate that competed for famesylation. Kinetic analysis by measuring initial velocities showed that famesyl protein transferase is a very slow enzyme. EDTA-treated famesyl protein transferase showed little activity with $Mg^{2+}$ or $Zn^{2+}$ alone, but required both $Mg^{2+}$ and $Zn^{2+}$ for the catalytic activity.

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Preparation of High-Purity Urokinase Using Single-Step Hydrophobic Interaction Chromatography with p-Aminobenzamidine Ligand

  • Cao, Xue-Jun;Zhou, Jian-Hua;Huang, Zhen-Hui;Wu, Xing-Yan;Hur, Byung-Ki
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제12권2호
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    • pp.196-203
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    • 2002
  • A novel process for urokinase purification was studied using p-aminobenzamidine as the ligand and sepharose 4B as the matrix. The adsorption, washing, and elution conditions were optimized by an unusual method. An adsorption buffer containing 2.5 M NaCl and $1\%$ Tween 80 facilitated the adsorption of urokinase on the affinity media and prevented contaminants from binding to the p-aminobenzamidine affinity gel. It was found that $5\%$ Tween 80 removed most of the contaminants from the affinity column. A 0.2 M glycine elution buffer containing 0.5 M NaCl (pH 3.0) was found to have a strong elution ability with a high recovery and purity of urokinase. A crude urokinase material of231 IU/mg protein from human urine was purified to 124,300 IU/mg protein with a purification factor of 538 and yield of $86.7\%$. As a result, a high purity urokinase was obtained with only a single affinity chromatography step. The purification process was successfully scaled-up to a 2-1 chromatography column. The resulting urokinase eluate could be directly lyophilized, thereby complying with Chinese pharmacopoeia (1995 version) standards.

미립자 응집반응을 이용한 C-reactive Protein의 면역 측정 법에 관한 연구 (Microparticle-based Immunonassay for the Detection of C-reactive Protein in Serum)

  • 김재화;송은영;이희구;최용경;최명자;김용호;최인성;정태화
    • 대한의생명과학회지
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    • 제2권1호
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    • pp.41-48
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    • 1996
  • 환자의 복수와 늑막액으로부터 p-diazonium phenylphosphorylcholine(DPPC) coupled Separose-4B affinity chromatography와 hydroxylapatite chromatography를 실시하여 C-reactive protein (CRP)를 분리, 정제하였다. 정제된 CRP를 토끼에게 면역화하여 항혈청을 얻고 affinity chromatography를 하여 면역항체(IgG)를 분리하였다. 분리된 면역항체를 미립자에 감작시킨 후 미립자 응집반응에 의하여 3분내에 CRP를 측정할 수 있는 간이 면역 측정법을 개발하였다. 본 연구에서 개발된 CRP측정법의 검출범위는 0.5~20mg/㎗이며, 임상 시험 결과 0.7~2.9mg/㎗에서는 강한 응집 반응을, 5.O~l3.2mg/㎗에서는 약한 응집반응을 보였고 28mg/dl이상에서는 항원 과잉으로 인한(zone of Ag excess phenomenon) 위음성을 나타냈다. 74명의 환자 혈청을 대상으로 CRP의 농도를 조사한 결과 평균치는 3.8mg/dl이었으며 대부분의 환자에서는 10mg/dl 이하의 농도로 존재하였다. 그러므로 1차 판정시 음성을 나타낸 시료라도 혈청을 5~10배정도 희석하여 재분석한다면 오차없이 CRP 를 검출할 수 있었다. 환자 혈청을 검체로 하여 본 연구에서 개발한 면역측정법과 현재 수입 시판 중인 프랑스의 B사 제품과 일본의 I사 제품을 비교한 결과 좋은 상관관계를 보였다. 이와 같은 평가 분석을 통하여 볼 때 본 연구에서 개발한 간이 면역 측정법은 사용이 비교적 간편하며 신빙성이 있어 CRP를 스크리닝하는데 효과적임을 알 수 있었다.

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Medium Optimization and Application of Affinity Column Chromatography for Trypsin Production from Recombinant Streptomyces griseus

  • Chi, Won-Jae;Song, Ju-Hyun;Oh, Eun-A.;Park, Seong-Whan;Chang, Yong-Keun;Kim, Eung-Soo;Hong, Soon-Kwang
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제19권10호
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    • pp.1191-1196
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    • 2009
  • The production of Streptomyces griseus trypsin (SGT) by S. griseus IFO13350 transformed with the expression vector pWHM3-TR1R2, containing sprT encoding SGT and the two positive regulatory genes sgtR1 and sgtR2, was investigated in various media. Cultivation in Ferm-0 gave 1.4 times more trypsin activity than in C5/L medium. In addition, replacement of 2% glucose and 1% skim milk in Ferm-0 with 2% dextrin and 1% tryptone (designated Ferm-II) enhanced trypsin activity 4.1-fold. To simplify the purification process, the supernatant from the S. griseus transformant cultured in Ferm-II medium was fractionated with ammonium sulfate (25-55%), then subjected to Hitrap Benzamidine FF affinity column chromatography. The specific activity of SGT purified by one-step chromatography was 69,550 unit/mg protein and the overall purification yield was above 8%, indicating that this method is more effective than those previously reported. Purified SGT was most active at pH 8.0 and $50^{\circ}C$, and it maintained activity between pH 7.0 and 9.0 and at temperatures up to $70^{\circ}C$. These enzymatic properties are very similar to those of authentic eukaryotic trypsin purified from bovine pancreas.

Casein으로부터 Alcalase에 의해 생성된 철분결합 Peptide (Iron Binding Peptides from Casein Hydrolysates Produced by Alcalase)

  • 최인욱;김기성;임상동;임신원
    • 한국식품과학회지
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    • 제30권1호
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    • pp.218-223
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    • 1998
  • 우유 casein단백질을 alcalase로 가수분해시켰을 때, 생성되는 peptide 중 철분과 결합력이 있는 peptide인 IBP가 $immobilized\;Fe^{3+}\;affinity\;chromatography$에 의하여 용이하게 분리되었다. IBP의 분자량은 2,175 dalton이었으며 $pH\;6,\;37^{\circ}C$에서 1시간동안 일정량의 철분과 항온처리하였을 경우, 25, 50, 100 g/mL의 IBP는 각각 4.2, 5.7, 7.1 g의 철분을 가용화시키는 능력을 보였다. IBP는 proline (24.5 Mol%), lysine (15.7 Mol%), glutamic 또는 glutamine (14.9 Mol%) 등의 아미노산으로 구성되어 있었으며 이들의 N-terminal sequence는Met-Ala-Pro-Lys-His의 순으로 이루어져 있었다. 분자량, 아미산 조성, N-terminal sequence등의 결과를 종합해 보면 IBP는 casein 중 -casein의 아미노산 서열 $102{\sim}119$에 해당하는 18개의 아미노산으로 구성된 peptide임을 알 수 있었다.

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Purification and Characterization of the Recombinant Arabidopsis thaliana Acetolactate Synthase

  • 조규봉;홍성택;최명운;장수익;최정도;고은희
    • Bulletin of the Korean Chemical Society
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    • 제18권6호
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    • pp.648-653
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    • 1997
  • Acetolactate synthase was purified from Escherichia coli MF2000/pTATX containing Arabidopsis thaliana acetolactate synthase gene. Purification steps included DEAE cellulose ion exchange column chromatography, phenyl sepharose hydrophobic column chromatography, hydroxylapatite affinity column chromatography, and Mono-Q HPLC. Molecular weight was estimated to be ∼65 KDa and purification fold was 109 times. The enzyme showed a pH optimum of 7 and the $K_M$ value was 5.9 mM. The purified enzyme was not inhibited by any of the end products, valine, leucine, and isoleucine.

Mannobiose-Sepharose 담체합성 및 Affinity column chromatograpy에 의한 Debaryomyces sp. 유래 ${\alpha}$-Galactosidase의 정제 및 기질 특이성 (Purification and Substrate Specificity of Debaryomyces sp. ${\alpha}$-Galactosidase by Mannobiose-Sepharose Affinity Column Chromatograpy)

  • 박귀근
    • Applied Biological Chemistry
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    • 제49권3호
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    • pp.180-185
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    • 2006
  • 본 연구는 Debaryomyces sp.가 생산하는 ${\alpha}-galactosidase$의 mannobiose-sepharose 담체합성법에 의한 affinity column chromatography를 수행하여 효소정제, 효소 화학적 성질 및 galactosyl mannooligosacchrides에 대한 기질특이성 규명을 주요 목적으로 하였다. 배양시간별 활성과 pH의 변화에서 배양시간 40시간부터 활성이 증가하고 있으며, 70시간에서 25.8unit/ml의 최대활성을 나타내고 있으며, 배양초기 pH 6.0에서 시작되어 배양말기에는 pH 8을 나타내는 pH의 변화를 보였다. 최적 pH는 4.0, 최적온도는 $60^{\circ}C$이며 $pH\;3{\sim}4.5$에서 100%의 잔존활성을 나타낸 반면 pH 8.0에서는 20%로 급격히 감소하였고. 온도안정성에서 $30{\sim}50^{\circ}C$에서는 100%의 잔존활성을 나타내었으나 $70^{\circ}C$ 이상에서는 20% 이하의 잔존활성을 나타내었다. $Hg^{2+}$에 의해서 54%, $Ag^{2+}$에 의해서는 85%로 저해되었으며, 그 이외의 이온에 대해서는 큰 영향을 받지 않았다. Debaryomyces sp.유래 ${\alpha}-galactosidase$는 24시간 반응 후 melibiose, $Gal^3Man_3$를 완전 가수분해 하여 각각 galactose와 glucose, galactose와 mannotriose로 분해되었으나 $Gal^3Man_4$에 대해서는 12시간 반응시켜도 기질로부터 galactose 유리가 불가능함이 확인되었다.

Paper Chromatogaphy 법(法)에 의한 SH화합물간(化合物間)의 수은(水銀)에 대(對)한 친화력(親和力) 비교(比較) (Affinity of Mercury to SH Compounds Compared by Using the Paper Chromatography)

  • 김영희;이만정
    • 한국식품영양과학회지
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    • 제10권1호
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    • pp.67-76
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    • 1981
  • Paper Chromatography 법(法)으로 아미노산류(酸類)와 이노신산(酸) 및 수은중독(水銀中毒) 치료제(治療劑)인 BAL의 수은(水銀)에 대(對)한 친화력(親和力)의 크기를 비교(比較)하였다. 그 결과(結果) Cysteine Cystine 및 Methionine의 3종(種)의 합류황(合硫黃) 아미노산(酸)은 수은(水銀)과 쉽게 결합(結合)하였으나 다른 아미노산(酸)들과의 결합(結合)은 확인(確認)하지 못하였다. 수은(水銀)은 SH기(基)를 가지는 Sodium thiosulfate 및 BAL과는 쉽게 결합(結合)하였으며 이노신산(酸)과도 쉽게 결합(結合)하였다. 이들 함류황(含硫黃) 아미노산(酸) 류(類)보다 큰 것으로 판단(判斷)되었다.

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