• 한국산학기술학회논문지
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• 제10권6호
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• pp.1287-1291
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• 2009

시안화물을 포름아미드로 변환시키는 nitrilase의 일종인 시안 수화효소 (cyanide hydratase, CHT) 를 진균류인 Neurospora crassa 와 Aspergillus nidulans로부터 유전자 조작을 통하여 His에 태그 또는 언태그된 형태로 대장균에 형질변환시켜 발현하였다. 발현된 효소를 고정 metal affinity chromatography로 정제하였다. 정제된 효소들의 pH 안정성, 동력학적 매개변수의 값을 검토하였다. 실험 결과 N. crassa 의 CHT가 50% 정도 더 넓은 pH 안정 범위를 가졌고 3배 가량 turnover rate도 높았다. 반면 A. nidulans CHT의 Km 값 (효소포화 용량)이 N. crassa CHT보다 더 크게 나타났다. 두 진균류에서 CHT의 유도발현은 질소성분과 상관없이 KCN에 의해 가능하였으며, 생분해 실험결과 N. crassa CHT에 의해 최대 82%/h의 시안분해가 가능하였다.

• 생명과학회지
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• 제18권3호
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• pp.350-356
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• 2008

가지 열매로부터 neutral saline에 의한 추출, $(NH_4)_2SO_4$ 침전 및 Sephadex-G100을 이용한 affinity chromatography에 의해 분리한 lectin의 생화학적 특성을 연구하였다. Trypsin을 처리하지 않은 사람, 쥐와 토끼의 적혈구에서는 혈구 응집반응이 일어나지 않았으며, Trypsin을 처리한 사람, 쥐와 토끼의 적혈구 중에서는 쥐의 적혈구에서만 혈구 응집반응이 일어났다. SDS-PAGE에 의해 가지 lectin의 분자량을 확인한 결과, 19.3 kDa의 단일 band 임이 확인되었다. D-glucose를 포함하는 7개의 탄수화물은 100 mM 이하의 농도에서 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 탄수화물에 대한 특이성이 나타나지 않았다. 최적 반응온도 범위는 $10-20^{\circ}C$로서, $20-70^{\circ}C$에서 열에 대해 안정하였으며, 안정된 pH 범위는 pH 6.2-7.2로 확인되었다. $Ca^{2+},\;Co^{2+},\;Cu^{2+},\;Fe^{2+},\;Mg^{2+}$ 및 $Mn^{2+}$ 20 mM 이하의 농도에서는 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 금속이온에 대한 특이성이 나타나지 않았다

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권11호
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• pp.1516-1524
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• 2014

Flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH) can utilize a variety of external electron acceptors and also has stricter substrate specificity than any other glucose oxidoreductases, which makes it the ideal diagnostic enzyme in the field of glucose biosensors. A gene coding for a hypothetical protein, similar to glucose oxidase and derived from Aspergillus terreus NIH2624, was overexpressed in Pichia pastoris GS115 under the control of an AOX1 promoter with a level of 260,000 U/l in the culture supernatant after fed-batch cultivation for 84 h. After a three-step purification protocol that included isopropanol precipitation, affinity chromatography, and a second isopropanol precipitation, recombinant FAD-GDH was purified with a recovery of 65%. This is the first time that isopropanol precipitation has been used to concentrate a fermentation supernatant and exchange buffers after affinity chromatography purification. The purified FAD-GDH exhibited a broad and diffuse band between 83 and 150 kDa. The recombinant FAD-GDH was stable across a wide pH range (3.5 to 9.0) with maximum activity at pH 7.5 and $55^{\circ}C$. In addition, it displayed very high thermal stability, with a half-life of 82 min at $60^{\circ}C$. These characteristics indicate that FAD-GDH will be useful in the field of glucose biosensors.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제56권5호
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• pp.711-717
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• 2018

상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 세포 분열을 자극하고 의약적 용도가 다양하다. EGF는 3개의 이황화 결합을 갖고 불용성으로, 대장균에서 고효율 발현에 대한 연구가 잘 이루어지지 않았다. EGF 유전자를 작은 유비퀴틴 관련 유전자(small ubiquitin-related modifier gene, SUMO)와 결합하고 DE3 대장균에서 발현시켰다. IPTG (Isopropyl-${\beta}$-D-Thiogalactopyranoside)로 유도하여 대장균 세포 단백질의 38.9%로 융합단백질이 발현되었고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 분리하였다. 그 후 유비퀴틴 분해효소반응으로 융합단백질에서 EGF를 얻은 후 다시 Ni-NTA 크로마토그래피로 분리 하였다. 최종적으로 정제된 EGF의 순도는 HPLC로 분석하였으며, 98%이상의 순도를 얻을 수 있었다.

• 약학회지
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• 제47권6호
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• pp.410-416
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• 2003

Autotaxin(ATX) was originally purified from conditioned media of A2058 human melanoma cells and shown to be a potent cell motility-stimulating factor, possessing a type II nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (NPP2) activity. Recombinant ATX has recently demonstrated that human plasma lysophosholipase D is identical to ATX and uses lysophosphatidylcholine as a substrate to mediate various biological functions including tumor cell growth and motility through G-protein coupled receptor. However, despite pivotal roles of ATX on physiological or pathophysiological states, the production of ATX is solely depends on complicated purification method which employs multiple column steps, but resulted in very poor yield. This limited the use of ATX for extensive analysis. We, therefore, expressed six histidine-tagged recombinant human ATX(His-ATX) in High Five TM insect cells to improve the generation of ATX and to make simple the purification of ATX. The signal sequence of the human ATX gene was truncated and replaced with sequence of insect cell secretion signal within expression vector. In addition, codons for six histidines were added to the C-termini of 120kDa ATX cDNA construct. A simple purification scheme utilizing two-step affinity column chromatography was designed to purify His-ATX to homogeneity from the culture supernatant of transfected insect cells. Homogenous His-ATX was detected and isolated from the concentrated insect cell medium using concanavalin A agarose and nickel affinity chromatography. Purified His-ATX was in full length with ATX capacity. A combination of this expression system and purification scheme would be useful for production and purification of high-quality functional ATX for research and practical application of multiple functional motogen, ATX/NPP-2.

• Applied Biological Chemistry
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• 제41권7호
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• pp.505-509
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• 1998

Pathogenesis-related proteins중 chitinase를 지황에서 추출하고 분류하였다. 지황 chitinase는 chitin affinity column chromatography로 염기성 및 산성 두개 군으로 분류되었으며 native PAGE gel상 효소활성을 조사한 결과 이동도가 작은 염기성 chitinase는 pH 2.9의 산성추출 조건에서, 이동도가 큰 산성은 pH 8.8의 염기성추출 조건에서 상대적으로 많이 추출되었다. 지황에는 염기성 3개, 산성 4개등 총 7개의 chitinase isoform이 존재하며 이들의 분자량은 $28{\sim}32\;kD$내외이고 지상부와 달리 뿌리에는 주로 염기성 chitinase만 검출되어 일부 산성효소는 조직 특이적으로 발현될 가능성을 보여주고 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권8호
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• pp.1310-1315
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• 2019

Hyaluronidases enhance therapeutic drug transport by breaking down the hyaluronan barrier to lymphatic and capillary vessels, facilitating their tissue absorption. Commercially available hyaluronidases are bovine in origin; however, they pose risks such as bovine spongiform encephalopathy. The present study aimed to develop a novel, highly active hyaluronidase and assess its function. Therefore, in order to find the most efficient active hyaluronidase, we produced several shortened hyaluronidases with partial removal of the N- or C-terminal regions. Moreover, we created an enzyme that connected six histidines onto the end of the hyaluronidase C-terminus. This simplified subsequent purification using $Ni^{2+}$ affinity chromatography, making it feasible to industrialize this highly active recombinant hyaluronidase which exhibited catalytic activity equal to that of the commercial enzyme. Therefore, this simple and effective isolation method could increase the availability of recombinant hyaluronidase for research and clinical purposes.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제15권1호
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• pp.1-9
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• 1997

본 실험에서는 한우초유를 33% ammonium sulfate 포화용액으로 처리하여 조면역글로블린을 얻은 후 gel filtration, ion-exchange chromatography를 이용하여 조면역글로블린의 분리 정도를 조사하고 affinity chromatography column을 이용하여 조면역글로블린으로 부터 Ig G의 결합정도를 알아보고 Protein G Sepharose fast flow system을 이용하여 신속하게 대량으로 Ig G의 분리를 꾀하여 얻어진 Ig G를 이용하여 ELISA방법으로 항체 생성유무를 측정하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 1. HPLC상에서 Superose 12 column을 이 용하여 한우초유의 조면역글로블린을 분리한 결과 Holstein초유의 조면역글로블린과 유사한 분리정도를 나타냈지만 약 84%의 Ig G를 한우초유의 조면역글로블린으로 부터 분리할 수 있었다. 2. Mono Q를 이용하여 HPLC에서 한우초유의 조면역글로블린을 gel filtration방법보다 짧은 시간에 분리할 수 있었지만 그다지 분리 정도가 좋지 않은 것으로 나타났다. 3. Hi-trap protein G column이 protein A sepharose CL-4B column보다 더 많은 양의 Ig G를 한우초유의 조면역글로블린으로 부터 얻을 수가 있었다. 4. Protein G Sepharose fast flow system을 이용하여 20mg의 sample양을 주입하여도 충분히 Ig G를 분리할 수 있었으며, ml 당 약 1.25mg의 Ig G를 얻을 수가 있었다. 5. ELISA방법을 이용하여 한우초유의 Ig G에 대한 항체 생성 유무를 측정한 결과, 면역화된 토끼에서 정상 토끼의 혈청에서보다 titer가 높게 나타났으므로 항체생성이 확인되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제35권5호
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• pp.791-796
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• 2003

박피된 절편 연근의 갈변억제를 효과적으로 하기 위한 기초연구로 갈변의 주원인 효소인 polyphenol oxidase(PPO)를 분리, 정제하여 특성을 조사하였다. 박피된 절편 연근을 24시간 동안 $4^{\circ}C$에 방치하여 PPO 활성을 증가시켜 조효소액을 제조하였으며 PPO 조효소액을 acetone으로 침전시킨 후 Q-Sepharose anion-exchange column, Phenyl-Sepharose hydrophobic interaction column의 conventional column과 Mono-Q anion-exchange column, Superdex 75 gel-filtration column의 HPLC column을 이용하여 PPO 활성이 가장 높은 한 개의 PPO isoform LPIII-2를 최종 분리 정제하였다. 분리 정제된 LPIII-2의 분자량을 gel-filtration chromatography를 이용하여 측정한 결과 56kDa이었으며 SDS-PAGE를 실시한 후 silver staining한 결과 LPIII-2의 분자량은 28kDa와 26kDa으로 2개의 band를 형성하는 것으로 보아 heterodimer인 것으로 추정되었다. PPO isoform의 특성 조사를 위하여 Q-Sepharose anion-exchange chromatography를 이용하여 부분분리 정제된 2개의 isoforms(LP-II, LP-III)를 가지고 기질 특이성을 조사한 결과 LP-II의 경우 $5^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$ 모두 catechol에 대한 기질 친화력이 높았으며 LP-III의 경우 $5^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$ 모두에서 pyrogallol에 기질 친화력이 높았다. 그리고 pH 7에서 최적 pH를 보였으며 열안정성은 $40^{\circ}C$에서 60분간 열처리했을 때 안정하였지만 $60^{\circ}C$에서 40분, $80^{\circ}C$에서 10분간 열처리했을 때 효소가 불활성화되었다. 특이하게도 연근의 PPO는 다른 과채류의 PPO와 반응온도에 따른 특성이 달랐는데 여러 반응온도에서 효소 활성을 측정한 결과 연근 PPO isoform LP-II와 LP-III 모두 $5^{\circ}C$의 반응온도에서 높은 효소활성을 보였으며 온도가 올라갈수록 반응속도가 떨어지는 특성을 보였다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제25권2호
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• pp.141-148
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• 1987

실험적으로 폐홉춘을 감염시킨 백서의 혈청내 항원을 ELISA 법으로 측정하였다. 시험용 혈청은 폐흡충의 피낭유충을 마리당 25개씩 먹인 총 22마리의 백서에서 감염후 12주가 될 때까지 채혈하여 얻었다. 폐흡충에 대한 특이항체는 폐흡충 감염 고양이의 혈청으로부터 ammonium sulfate 침전과 anionezchange chromatography를 이용, IgG를 분리한 후 affinity chromatography를 이용하여 순수분리하였다. 항원을 찾기 위한 ELISA는 소위 "double antibody sandwich method"를 사용하였다. 대조로서 사용한 감염전 혈청의 O.D.치 평균값은 0.04(표준편차 0.04)이었으며 감염후 O.D.치 (표준편차)의 변화를 보면 0.5주(3일)는 0.03(0.01), 1주는 0.55(0.50), 1.5주는 0.69(0.45), 2주는 0.20(0.19), 2.5주는 0.13(0.10)이었고 감염 3주 이후는 대조 혈청의 값으로 떨어졌다. 대조혈청의 $평균간+3{\times}$ 표준편차, 즉 0.16이하를 이 system에서의 비특이적 수치로 잡았을 때 이 이상의 수치를 나타낸 경우는 감염 후 1주부터 2.5주까지의 혈청에서만 관찰되었다. 한편 감염 12주 후에 총 10마리의 백서를 희생시켜 유충을 회수하여 보았다. 폐와 흉강에서는 평균 2.2마리, 근육에서는 평균 6.2마리의 유충을 회수할 수 있었다. 폐흡충 감염 백서에 있어 충체가 생산하는 항원은 감염 1주 후부터 혈청 내에서 검출되었다. 그러나 감염 3주후부터는 검출되지 않았는데 이것은 항원-항체 복합체 형성에 의한 반응 저해 현상에 의한 것으로 생각되었다.