• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권1호
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• pp.87-94
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• 1996

For evaluating the suitability of human follicular fluid(HFF) as protein supplement in ART, this preliminary study was performed to examine the maturation promoting activity of HFF on mouse follicular oocytes in vitro. Mouse follicular oocytes were collected from ovaries of 21-28 day old ICR mice by puncturing the antral follicles with fine needle at 48 hours after PMSG injection. The oocytes were rinsed and cultured in modified Whittingham's $T_6$ medium containing purines or dbcAMP to maintain meiotic arrest, and different concentrations of HFF were added into the culture medium to examine the effect of HFF on releasing the oocytes from the suppressive influence of the meiotic inhibitors. As a control for HFF, the maturation promoting activity of human fetal cord serum(HFCS) was investigated and compared with the activity of HFF. While HFF was separated, by molecular weight(M.W), into high M.W. fraction(M.W>30,000) and low M.W. fraction(M.W<30,000) and the effects of the fractions on meiotic resumption were investigated in the presence of the meiotic inhibitors. Also hormone analysis was performed to compare the content of hormones in HFF with that in HFCS. Same concentrations of HFF and HFCS induced similar germinal vesicle break down(GVBD) rates of the oocytes meiotic arrested by purines(4mM hypoxanthine+0.75mM adenosine), but the extrusion rate of 1st polar body(PB) of the oocytes cultured in HFF(65.0%, P<0.05) was significantly higher than that(51.6%) in HFCS. While, in the presence of 200 M dbcAMP, the maturation promoting activity of HFF (GVBD: 70.5%, $p<10^{-6}$; 1st PB extrusion: 67.1%, $p<10^{-3}$) was significantly greater than that of HFCS(GVBD: 35.2%; 1st PB extrusion: 41.1%). The oocytes cultured in the fraction of HFF containing high M.W. components showed higher meiotic maturation rates than the oocytes cultured in the low M.W. fraction of HFF. Gonadotropins and $E_2$ were known to improve the completion of maturation changes, and the levels of these hormones were higher in HFF than in HFCS. Therefore, HFF was more effective than HFCS to use for promoting meiotic resumption of mouse oocytes in vitro.

• 한국수정란이식학회지
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• 제25권1호
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• pp.1-7
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• 2010

The objective of this study was to examine the effect of vitamin B (pantothenic acid, folic acid, and myo-inositol) that was supplemented to embryo culture medium on in vitro development of parthenogenetically activated (PA) pig embryos. Cumulus-oocyte complexes derived from slaughtered ovaries were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (hCG and eCG) for the first 22 h and then further cultured in hormone-free medium for an additional 22 h. After maturation culture, metaphase II oocytes that extruded 1st polar body were electrically activated and treated with $5.0\;{\mu}g/ml$ cytochalasin B for 4 h. Then, PA embryos were cultured for 7 days in a modified NCSU-23 that was supplemented with pantothenic acid, myo-inositol, or folic acid at different concentrations ($3{\sim}300\;{\mu}M$) according to the experimental design. Myo-inositol added to culture medium did not show any beneficial or inhibitory effects on embryo cleavage and blastocyst formation. However, $300\;{\mu}M$ pantothenic acid significantly inhibited blastocyst formation compared to control (no addition) (24% vs. 36%, p<0.05). Folic acid ($300\;{\mu}M$) significantly (p<0.05) increased blastocyst formation (56%) compared to control (41%). Our results demonstrated that in vitro development of PA embryos was significantly influenced by vitamin B and addition of $300\;{\mu}M$ folic acid to culture medium improved in vitro development of pig PA embryos.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제21권4호
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• pp.425-434
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• 2017

Polyploidy is occurred by the process of endomitosis or cell fusion and usually represent terminally differentiated stage. Their effects on the developmental process were mainly investigated in the amphibian and fishes, and only observed in some rodents as mammalian model. Recently, we have established tetraploidy somatic cell nuclear transfer-derived human embryonic stem cells (SCNT-hESCs) and examined whether it could be available as a research model for the polyploidy cells existed in the human tissues. Two tetraploid hESC lines were artificially acquired by reintroduction of remained 1st polar body during the establishment of SCNT-hESC using MII oocytes obtained from female donors and dermal fibroblasts (DFB) from a 35-year-old adult male. These tetraploid SCNT-hESC lines (CHA-NT1 and CHA-NT3) were identified by the cytogenetic genotyping (91, XXXY,-6, t[2:6] / 92,XXXY,-12,+20) and have shown of indefinite proliferation, but slow speed when compared to euploid SCNT-hESCs. Using the eight Short Tendem Repeat (STR) markers, it was confirmed that both CHA-NT1 and CHA-NT3 lines contain both nuclear and oocyte donor genotypes. These hESCs expressed pluripotency markers and their embryoid bodies (EB) also expressed markers of the three embryonic germ layers and formed teratoma after transplantation into immune deficient mice. This study showed that tetraploidy does not affect the activities of proliferation and differentiation in SCNT-hESC. Therefore, tetraploid hESC lines established after SCNT procedure could be differentiated into various types of cells and could be an useful model for the study of the polyploidy cells in the tissues.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.427-432
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• 1997

These studies were performed to approach the precise pathway inducing the meiotic inhibitory action of hypoxanthine on mouse follicular oocytes and to identify the cause of detrimental effect of hypoxanthine on viability of the oocyte in vitro. In addition, a correlation between the meiotic inhibitory effect and the detrimental effect of hypoxanthine was investigated. Mouse follicular oocytes at germinal vesicle(GV) stage were collected from the ovaries of ICR mice by puncturing the antral follicles with a fine needle, at 48 hours after PMSG injection. Oocytes were cultured in Modified Whittingham's T6 media containing hypoxanthine and several materials that involved in metabolism of hypoxanthine, and the effects of the materials on the actions of hypoxanthine were investigated by observing germinal vesicle breake down (GVBD), 1st polar body (PB) extrusion and viability of the oocytes. Phophodiesterase significantly reduced the meiotic inhibitory effect of dbcAMP but did not influence on the inhibitory effect of hypoxanthine. Allopurinol and 6-MP significantly enhanced the meiotic inhibitory effect of hypoxanthine, but the materials themselves also showed the meiotic inhibitory action like hypoxanthine. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase significantly enhanced the meiotic inhibitory effect of hypoxanthine, on the contrary HGPRT itself promoted meiotic resumption of the oocytes. Catalase did not induce any change in the meiotic inhibitory effect of hypoxanthine, but SOD increased the GVBD rate suppressed by hypoxanthine. The detrimental effect of hypoxanthine on viability of the oocytes was significantly reduced by allopurinol and catalase, but SOD increased the GVBD rate suppressed by hypoxanthine. The detrimental effect of hypoxanthine on viability of the oocytes was significantly reduced by allopurinol and catalase, but SOD did not reduce the deterimental effect of hypoxanthine. In conclusion, the meiotic inhibtory effect of hypoxanthine may be caused by guanyl dervartives converted from hypoxanthine via salvage pathway, and superoxide anion may partially participate in the inhibitory effect of hypoxanthine. The detrimental effect of hypoxanthine on viability of the oocytes be cused by hydrogen peroxide produced during the metabolism of hypoxanthine.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.175-180
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• 2005

본 연구는 demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 체세포 핵이식란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 체외에서 $16\~20$시간 성숙배양된 난자를 극체 방출 유무 및 MI, MII기 난자로 구분하여 $0.4\;\muL/mL$ demecolcine으로 40분간 처리 후 염색체 부위가 돌출된 난자는 탈핵 후 핵이식에 공시하였다. 소의 귀 피부 세포를 탈핵란에 이식하여 전기융합과 활성화 처리(Ca-ionophore+DMAP)를 거쳐 체외 배양하였다. Demecolcine처리 후 $86.2\%$의 난자가 염색체 부위의 돌출을 보여 이 중 $98.8\%$가 탈핵에 성공하였다. Demecolcine은 핵이식란의 발육에 영향을 주지 않았다. 제1극체 방출란 유래 핵이식란의 배반포 발육율은 극체 미방출란 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 높았다($18.2\%\;vs.\;4.6\%\cdot$, P<0.05). 한편, MI 난자 유래 핵이식란의 분할율 및 배반포 발육율은($69.4\%$와 $5.9\%$) MII 난자 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 낮았다($96.7\%$와 $23.9\%$, P<0.05). 본 연구의 결과는 demecolcine 처리가 소 난자의 탈핵에 매우 효과적이며 MII기 난자가 MI기 난자에 비하여 수핵란 세포질로 더 적절하나 극체 미방출란 및 MI기 난자도 비록 제한적이기는 하지만 핵이식란의 배반포 발육을 지원할 수 있음을 보여준다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권2호
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• pp.101-111
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• 2001

본 실험은 preantral 난포를 antral 단계까지 성숙시 비교, 또 난포 성숙, 수정 및 배발달을 유도할 수 있는 체외배양체계를 개발하고자 시행되었다. 협막세포로 둘러쌓인 소 preantral난포 (150 $\pm$ 1.2 $\mu\textrm{m}$)를 1 mg/$m\ell$ collagenase와 0.2 mg/$m\ell$ DNase I가 포함된 Leibovitz L-15 배양액에서 효소적 방법과 물리적 방법으로 난소조직으로부터 분리하였고, 체외난포 성숙 배양액인 $\alpha$MEM을 기본 배양액으로 여러 농도의 FSH와 LH를 첨가하여 25일간 배양하였다. FSH (10~150 ng/$m\ell$) 첨가군의 성숙율과 생존율은 대조군의 그것보다 유의하게 높았으나(P ＜ 0.001), LH (1~125 ng/$m\ell$) 첨가군들과 대조군 사이에서는 유의차가 없었다. FSH (90 ng/$m\ell$)와 LH (25 ng/$m\ell$)를 공동첨가군의 생존율 (40%)과 성숙율 (244$\pm$0.5 $\mu\textrm{m}$)은 대조군의 그것 (25%, 160 $\pm$0.5 $\mu\textrm{m}$)보다 양호하였다. 결과적으로, preantral 난포를 25일간 체외배양한 후, 50%의 건강한 antral 난포를 획득할 수 있었고, 이들 난포중 60%가 제 1극체가 있는 완전한 감수분열을 이루었고 (18.1%), 10.0%가 배발달을 하여 배반포 단계에 이르렀다. 이런 결과는 협막세포가 있는 소 preantral 난포는 상기의 체외배양체계에 의해 antral 단계까지 성장할 수 있고, 체외에서 성숙된 소 preantral 난포의 난자는 분열능을 획득하고 수정 및 배발달이 가능하다는 것을 보여주었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권3호
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• pp.233-240
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• 2003

본 연구는 난자의 성숙시간, PHA-P 처리 또는 활성화 방법이 소 미수정란의 탈핵, 재구축란의 융합, 활성화 또는 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 미수정란은 성숙 후 16∼24시간에 탈핵을 실시하고, PHA-P 처리 또는 무처리된 귀 피부세포를 이식 후 전기융합을 실시하였다. 후자의 경우는 융합 전에 PHA-P로 15분간 배양하였다. 융합란은 A23187과 CHXM 혹은 DMAP의 병용처리에 의해 활성화를 유기하고, 7∼9일간 체외배양하였다. 탈핵율은 성숙 후 16∼18시간에 실시한 경우(70.2∼92.3%)가 성숙 후 20∼24시간(44.3∼3.4%)에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). M-II기 염색체의 위치는 성숙배양 시간이 길어짐에 따라 제 1 극체와의 간격이 멀어졌다. Donor 세포 혹은 재구축란에 PHA-P를 처리한 경우는 무처리구에 비하여 융합율이 향상되었다(P<0.05). 핵이식배의 분할율 및 배반포 발달율은 A23187+DMAP 처리구에서 78.6%와 32.9%로, A23187+CHXM 처리구에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). 본 실험 결과는 성숙후 18시간에 탈핵을 실시하는 것이 효과적이며, donor세포 또는 융합 전 재구축란의 PHA-P 처리가 융합율 향상시킬 수 있고, 또한, 융합란을 A23187과 DMAP으로 병용처리 함으로써 난자의 활성화 및 배반포 발육율을 향상시켜, 결과적으로 핵이식기술의 효율성을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권3호
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• pp.235-243
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• 2002

본 연구는 몇 몇 포유류로부터 얻은 공여세포핵의 proliferation을 돕기 위한 수핵난자로 소 난자의 세포질을 사용하였으며, 공통 세포질로써의 능력을 시험하였다. 소 난자와 소, 사람, 돼지, 생쥐의 체세포와의 결합에서 유래한 각 종별 핵이식란의 융합율, 분할율, 배발달률 그리고 염색체 수를 조사하였다. 1. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 융합율은 70.2% 70.2% 72.4%와 63.0 %로 유의차를 보이지 않았다. 2. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 체외분할 ($\geq$2cell cleavage)율 또한 60.6%, 63.7%, 54.1%와 62.7%로 유의차가 없었다. 3. 각 종별로 체외분할이 일어난 시기를 조사한 결과 종에 관계없이 대체로 활성화 처리 후 24시간째에 대부분 일어나는 것을 볼 수 있었다. 그러나 점차적으로 분할이 계속 이루어지면서 발달시기가 종 특이적인 특성을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 4. 이종간 핵이식의 후기 배발달 (상실배와 배반포) 률을 살펴보면 소와 사람의 체세포를 사용했을 경우 17.5%, 4.3%의 결과를 나타내었으며, 돼지와 생쥐의 체세포를 사용한 경우 16세 포기 이후 단계에 발달중지 현상을 볼 수 있었다. 5. 4~8 세포기 정도의 각 종별 핵이식란 할구를 분석에 사용하였을 때, 공여핵으로 사용된 종의 염색체 수와 일치하는 결과를 볼 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 성숙한 소 난자의 세포질은 소뿐만 아니라 돼지, 생쥐, 사람과 같은 다양한 포유류의 핵을 사용하여 핵이식을 하였을 때에도 발달이 가능하다는 것을 보여주고 있다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권3호
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• pp.245-252
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• 2002

본 연구는 체세포 핵치환에 탈핵 후 통격한 소미수정란을 사용함에 있어서, MVC 초자화 동결방법과 탈핵난자의 활성화시기가 융해 후 생존율과 핵치환 이후 체외 발달에 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다. 체외에서 20시간 동안 체외성숙된 소 미수정란은 수핵란으로 사용하기 위하여 5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ hoechst 처리 후, 형광현미경하에서 핵을 제거하였다. 본 실험은 세 그룹으로 나누어 실행되었다 Group I은 동결하지 않고 핵치환을 한 대조군이며, group III와 group II는 핵이 제거된 난자를 MVC 방법으로 동결하기 전과 후에 활성화 처리 (5$\mu\textrm{m}$의 ionomycin에 의해서 5분간 처리) 한 군이다. 초자화 동결을 위해서는 group II와 group III의 탈핵란은 EG10에서 5~10분간 전처리하고 EG30에서 30초간 노출하여 액체 질소에 침지하였다. 융해는 37$^{\circ}C$에서 4단계로 이루어졌다. 실험군은 모두 소 귀세포를 이용하여 핵치환을 실시하였으며, 전핵을 유도하기 위한 활성화를 위해서는 10$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ cycloheximide와 2.5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ cytochalasin D)가 첨가된 CRlaa 배양액에서 1시간, 이후 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ cycloheximide가 들어있는 CRlaa 배양액에서 4시간동안 배양하였다. 활성화 처리가 끝난 난자들은 CRlaa 배양액에서 2일간 배양하여 난할이 유도된 난자만을 선별하여 난구세포와 7일 동안 공배양하였다. 동결 융해 이후 group II와 group III의 탈핵된 소 미수정란의 체외 생존율은 81.0%와 84.9%로 유의적인 차이가 없었다. 체세포와 수핵란과의 융합율도 각각 69.0%와 70.0%로 대조군 (75.2%) 과도 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 난할율은 53.4%와 58.4%로 group II와 group III간에 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 group II의 분할된 세포질을 가진 이상난자의 비율이 group III보다 유의하게 높게 나타났다 (P<0.05). 또한, morula 이상으로 발달율도 group II (8.6%) 에서 group III (15.6%)보다 낮은 결과를 얻었다 하지 만 group III (15.6%)의 체외 발달율은 대조군 (24.8%)과 유의한 차이를 없었다. 따라서, MVC 동결 방법은 탈핵된 소 미수정란을 동결하기에 적합한 방법이며, 탈핵 후 activation을 유도하고 초자화 동결한 난자는 동결하지 않은 신선란과 동일하게 체세포 핵치환에 유용하게 이용될 수 있으리라 사료된다.