차세대 바이오에탄올로 주목받고 있는 목질계 바이오매스를 이용한 셀룰로오스 에탄올 생산과정은 셀룰로오스를 단당류로 분해하는 전처리과정이 가장 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 산가수분해와 효소당화과정을 이용하여 볏짚, 톱밥, 복사지, 신문지 등과 같은 목질계 바이오매스로부터 셀룰로오스에탄올을 제조하였다. 전처리과정으로 10~30 wt% 황산을 이용한 산가수분해($100^{\circ}C$, 1 h), celluclast ($55^{\circ}C$, pH = 5.0), AMG ($60^{\circ}C$, pH = 4.5), spirizyme ($60^{\circ}C$, pH = 4.2)을 이용한 효소당화과정(30 min), 산가수분해 후 효소당화과정을 비교하였다. 전처리과정의 수율은 hybrid 과정 > 산가수분해 > 효소당화 순으로 셀룰로오스 에탄올로의 전환이 잘 이루어지는 것으로 나타났으며, 최적 발효시간은 2일이었다. 또한 20 wt% 황산을 이용한 산가수분해 후 celluclast를 이용하여 효소당화를 수행할 경우 톱밥 > 볏짚 > 복사지 > 신문지 순으로 셀룰로오스 에탄올 전환특성이 높게 나타났다.
생전분 분해효소에 의한 전분의 당화에서 유리구를 첨가시켜 회전진탕시키므로 당화시간의 단축과 당화율의 증대에 효과가 있었다. 옥수수전분과 유리구의 중량비를 1 : 5로 하여 Streptomyces sp. 4M-2의 ${\alpha}-amylase$를 첨가하고 300rpm으로 교반시켰을 때 30시간 후에 88%, 감자전분에서 69%의 당화율을 나타냈다. 옥수수전분에서 amyloglucosidase를 병용하였을 때는 6시간 후에 88%의 당화율을 보였다.
볏짚은 한국에서 매년 대량 생산되는 주요 작물이다. 침지공정을 이용한 목질계 바이오매스의 전처리는 대기압과 $60^{\circ}C$의 온도에서 온화한 조건에서 수행되었다. 본 연구에서는 전처리된 바이오매스의 효소당화 조건을 찾아보았다. 볏짚의 경우에 이전의 목질계 바이오매스와 비교하여 당화시간이 다른 것들보다 짧은 것으로 나타났다. SAA(Soaking in Aqueous Ammonia) 전처리 볏짚의 당화는 40~48시간 사이에 종료가 되었고 $50^{\circ}C$에서 높은 글루코스 전환율을 나타냈다. 글루코스 전환율은 효소사용량이 각각 65 FPU/ml과 32 CbU/ml일 때 높았다. 기질 농도가 5%(w/v)일 때 전환율은 72시간 동안 당화 후에 83.8%로 나타났다. SAA 전처리 볏짚의 동시당화발효(SSF; Simultaneous Saccharification and Fermentation) 실험에서는 $40^{\circ}C$에서 높은 에탄올 생산수율을 보였다. 그때의 수율은 48시간에서 33.05%로 나타났다.
알코올 발효에 이용되는 타피오카와 겉보리 혼합원료의 효소당화액을 제조하여 알코올 발효 특성을 조사하였다. 타피오카와 겉보리 혼합원료를 내열성 액화효소인 Spezyme Fred를 0.04% 사용하여 액화하고 글루코아밀레이스(G), 단백질가수분해효소(P), 베타글루칸 가수분해효소(B)를 혼합한 당화효소제(GPB)를 사용하여 당화하였다. 타피오카와 겉보리 혼합원료(7:3, w/w)를 $50^{\circ}C$에서 150분간 당화하였을 때 당화액의 포도당 함량은 11.9%였고 점도는 26 cp로 나타났다. 베타글루칸 가수분해효소(B)의 첨가는 당화액의 포도당 수율의 증가와 점성의 저하에 도움을 주었다. 타피오카와 겉보리의 혼합비율을 7:3(w/w)으로 하였을 때 다른 비율의 당화액에 비하여 점도가 낮으며 포도당 함량이 높게 나타났다. 타피오카와 겉보리 혼합원료에 300%의 가수량으로 확립된 조건에서 당화하고 $30^{\circ}C$에서 72시간 알코올 발효를 수행한 결과 타피오카와 겉보리 혼합원료를 이용한 알코올 발효에 적합한 발효액의 알코올 및 포도당 함량은 각각 9.0과 0.02%였고, pH와 산도는 각각 pH 4.3과 0.3%이었다.
분쇄마찰매체효소반응계에서 glucoamylase와 Alpha-amylase의 보완작용에 의한 옥수수 생전분의 효소당화 mechanism을 규명코자, 분리.정제된 상기 효소의 혼합 비율에 따른 당화양상 및 생성당 조성, 전분입자 구조, 생전분입자의 particle size 분포, X-ray 회절양샹의 변화 등을 관찰하였다. 분쇄마찰매체 효소반응계에서도 효소를 분리하여 사용하였을 때보다 glucoamylase와 $\alpha$-amylase를 혼합사용할 경우 당화율이 크게 향상되었으며, 고순도의 glucose 생산에 적합한 두 효소의 혼합비율은 약 1:1-1:2(unit) 로 판명되었다.
Asp. usamii shirousamii $U_2$ 균의 국식 배양에 있어서 유기산 및 당화효소생성 조건에 대하여 실험한 결과는 다음과 같다. (1) 유기산 생산은 밀가루 및 밀기울 배지의 경우 $30^{\circ}C$에서 3일간 배양시에 가장 좋았으며 당화효소력은 밀가루 배지의 경우 $35^{\circ}C$, 3일간 배양시에 가장 높았고 밀기울 배지는 $35^{\circ}C$, 2일간 배양시에 거의 최고 역가를 나타냈다. (2) 3일 배양의 경우 배지의 첨수량은 밀가루 배지에서는 60% 첨수일 때, 밀기울 배지에서는 50% 첨수일 때 유기산 생성이 가장 좋았으며 당화효소 생성은 밀가루, 밀기울의 어느 배지에서나 $90{\sim}100%$ 첨수에서 가장 좋았다. (3) 밀가루와 밀기울의 배지를 비교하여 볼 때 유기산의 생성은 밀가루 배지가 좋았으며 당화효소생성은 밀기울 배지에서 높았다. (4) 고구마 전분박과 밀가루를 동량으로 혼합했을 때 밀가루 단일배지보다 유기산 및 당화효소 생성이 높았으며 밀기울에 고구마전분박 첨가의 효과는 없었다. (5) 밀가루, 밀기울 단일배지에 비하여 고구마전분박 단일배지에서는 유기산 및 당화효소 생성이 극히 나빴다. (5) 60% 첨수의 밀가루배지에서 $30^{\circ}C$, 3일간 배양한 경우 생성유기산 중의 약 90%가 구연산이었다.
본 연구에서는 에탄올의 생산단가를 낮추기 위해, 음식물쓰레기 당화액을 이용하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시키기 위해 회분식의 반연속식 동시당화발효 시스템을 개발하였다. 음식물쓰레기 200 g와 최종효소액 (amylase 기준으로 $3.0\;U/m{\ell}$) $40\;m{\ell}$가 반응하였을 때 생산되는 환원당의 속도는 $35^{\circ}C$에서 $5.84\;g/{\ell}{\cdot}h$로서, strain KJ가 소비하는 환원당 속도는 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}h$와 비슷하여 동시당화발효의 최적온도는 $35^{\circ}C$로 결정되었다. 그리고 음식물쓰레기 당화를 위한 최적 효소농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로서 생산되는 환원당의 속도는 4.80 g/L h이었다. 이는 에탄올 생산균주가 $35^{\circ}C$에서 소비하는 환원당의 속도인 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}hr$와 비슷하므로, 효소의 최적농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로 결정하였다. Fed-batch식 동시당화발효에서 생산된 환원당을 다 소모하고 나서 12시간 단위로 음식물쓰레기를 공급하여 배양한 결과, 배양 120시간째 에탄올발효 후의 잔존 환원당 농도는 $18.3\;g/{\ell}$, 생성된 에탄올 농도는 $64\;g/{\ell}$, 에탄올의 수율은 0.45 g-ethanol/g-reducing sugar이었다. 그리하여 음식물쓰레기의 Fed-batch식 동시당화발효기술을 개발하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시킴으로써 에탄올 수율을 향상시키는데 성공하였다.
증자하지 않은 cassava 생전분의 ethanol 발효생산을 위한 동시당화 -발효의 최적조건을 검토하였다. 생전분의 분해력이 가장 좋은 당화효소의 선별에서는 Asp. shirousami27이 가장 좋았으며 발효효모는 균주에 따라 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 동시당화-발효는 pH3.6에서 가장 높았으며 발효전 6$0^{\circ}C$에서 당화효소에 의한 전당화와 발효시 교반등이 발효속도 및 발효율에 효과가 있었고, 분쇄처리도 효과가 있었다. cassava 생전분의 동시당화-발효에서 5일간의 긴 발효 기간을 요구하는데 발효중 발효액의 성분 조사 결과 중간물인 glucoserk 축적되지 않는 것으로 당화과정이 속도결정단계임을 알 수 있다.
불용성 기질인 섬유소의 고효율 효소당화에 적합한 분쇄마찰매체함유 반응장치의 개발을 목표로 섬유소-효소-분쇄마찰매체함유 반응장치의 개발을 목표로 섬유소-효소-분쇄마찰매체의 혼합액을 통자체를 회전시켜 교반마찰시키는 tumnling drum type bioreactor를 제작하여 그 효용성을 검토하였다. 반응조 내부의 구조 및 제반 운전조건하에서의 당생성 효울을 분쇄마찰매체의 교반에 소요되는 에너지와 비교분석 검토함으로써 공업적 규모의 활용을 위한 기술적, 경제적 타당성을 평가하였다. 3L규모의 장치의 경우 반응조내경과 baffle의 크기의 비가 1:0.05이고 8개의 baffle을 설치한 반응조에서 3mm glass bead를 600g/l로 첨가하여 100rpm으로 교반할 때 가장 우수한 결과를 얻었다. Tumbling drum type bioreactor는 매우 효율적인 attrition coupled된 당화장치로 판단되며, 특히 산업적 규모로 scale-up하기 용이한 구조를 갖고 있어 이에 대한 구체적 연구가 요망된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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