본 연구에서는 히루딘을 생산할 수 있는 재조합 S. cerevisiae 에서 ‘히루딘 유전자의 copy number 와 히루딘 발현양과의 관계를 규명하였으며 , ${\delta}$ 서열을 이중으로 사용한 히루딘 발현벡터를 제조하여 히루딘 유전자의 효모염색체로의 도입효율을 증가시켰다. 숙주세포인 효모의 GALl 유전자를 파쇄하여 균체에 의한 갈락토스 소모를 방지하여 보다 경제적으로 히루딘을 생산할 수 있는 시스템을 개발하였으며, 재조합 H. polymorpha을 이용한 발효공정에서 히루딘 생산을 위한 최적의 메탄올 농도를 결정하였다.
절간고구마 주정폐액은 여과가 용이하고, 유기질 함량이 높으며 pH가 효모의 생육에 적합하여 미생물의 단세포 단백질(single cell protein) 생산을 위한 기질로 적합하였다. 본 실험에 사용한 Candida boidinii는 토양으로부터 분리된 고구마 주정폐액 자화성이 가장 우수한 균주로서, 72시간 배양하였을 때 배지 100ml당 1.02g의 건조균체량을 얻을 수 있었으며, 이 때의 조단백질 함량은 54.5%였다. 효모의 생육은 pH 5.0과 $30^{\circ}C$에서 72시간 배양하였을 때 최대에 달하였고 urea 0.2%와 무기염류를 첨가하면 생육이 촉진되었다.
사탕무즙을 이용한 알콜생산에서 배출되는 증류폐액(sugar beet stillage)을 기질로 고온성 효모인 Candida rugosa를 이용해 단세포단백을 생산 할 때 기질의 최적화와 COD 감소를 연구하였다. 인의 첨가는 실험에 사용된 3가지 모든 시료기질에 꼭 필요한 것으로 나타났고 질소첨가는 기질의 잔당농도가 높을 경우에 필요하였다. 모든 시료에 있어서 인의 첨가는 생균생산율(Biomass production)을 23-61% 까지 크게 높였다. 이에 비해 질소의 첨가는 잔당함량이 높을 경우 생균생산율을 약간 상승시켰으나 질소와 함께 첨가할 경우 90%까지 크게 높였다. COD는 인의 첨가로 인해 26-46%까지 더 감소되었으며 질소와 함께 첨가할 경우 85%까지 크게 감소되었다.
재조합 효모를 이용한 hirudin 발효생산조건의 최적화 연구를 수행하였다. Hirudin 유전자는 GAL10 promoter와 MFal 분비신호, GAL7 terminator와 결합되어 있다. 재조합 효모의 성장속도와 hirudin 최종 농도를 증가시키기 위하여 최적의 배지조성과 배양조건을 결정하였다. 최적의 배지조성과 배양조건은 yeast extract 40g/$\ell$, casamino acid 5g/$\ell$, 포도당 20g/$\ell$, galactose 30g/$\ell$, DO 50%, 온도 $30^{\circ}C$였다. 이 조건으로 2.5$\ell$ 발효조에서 회분식배양을 수행한 결과 비성장속도는 $0.13hr^{-1}$, 최종 건조균체농도는 30g cell/$\ell$, 최종 hirudin 농도는 64mg/$\ell$로 나타났다.
용존 유기물의 농도를 BOD로 신속히 측정하여 폐수처리 공정에 feed back할 수 있는 Yeast BOD sensor 를 제작하여 BOD 측정의 거동을 조사하였다. BOD sensor의 감응도는 yeast의 활성이 가장 높은 pH 7.0 및 온도 $30^{\circ}C$에서 가장 높게 나타났다. Sensor에 충전되는 효모의 양도 감응도에 영향을 미치며 투석막 단위면적당 $ 0.14\;mg/cm^2$가 최적의 균체량이었다. 오염물질의 종류에 따라 BOD sensor의 출력 신호가 다르게 나타났으며 각각의 오염물질 속에 효모균를 전처리 시킨 후 sensor에 충전할 경우 sensor 의 감응도가 크게 증가하였다.
영지(Ganoderma lucidum) 열수추출물이 지질생성효모(Rhodotorula glutinis)의 증식과 지질함량 및 지방산 조성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 영지추출물을 각각 0 ($S_0$), 0.1 ($S_1$), 0.01 ($S_2$) 및 1.0% ($S_3$)되게 첨가한 기본배지에 R. glutinis를 접종하여 $30^{\circ}C$에서 8일간 진탕배양하면서 그 효모의 생육도, 당 소비량의 변화, 지질함량 및 지방산 조성을 조사하였다. 영지추출물의 첨가량이 증가할수록 균체증식은 증가하였으며, 배양 8일에는 $S_1,\;S_2$ 및 $S_3$구가 $S_0$구보다 각각 1.5배, 1.6배, 및 2.1배로 증가하였으며 8일 후 당 소비율은 감소하는 경향이 있었다. 균체지질함량은 영지추출물의 농도가 증가함에 따라 40% ($S_0$)에서 41.5% ($S_1$), 43.7%($S_2$) 및 46.7% ($S_3$)로 증가하였고 균체 지방산은 myristic, palmitic, stearic, oleic, linoleic acid 등이였으며 불포화지방산의 함량(38.6 mg/g)이 포화지방산의 함량(22.3 mg/g)보다 많았다. 영지추출물의 농도가 증가함에 따라 각 처리구의 균체 지방산함량은 myristic acid를 제외한 모든 산이 증가하였는데, 그 중 $S_2$에서 가장 많았으며, $S_3$구에서는 $S_1$구보다도 감소한 반면, myristic acid는 $S_3$에서 가장 높게 나타났다.
글루타티온은 간 질환용 치료제 내지는 영양보충제로 시판되고 있다. 이전 실험에서 글루타티온 고함유 효모 Saccharomyces cerevisiae FF-8 균체(FF-8GY) 투여가 사염화탄소 및 알코올성 유발 간독성 개선효과를 나타내었다. 따라서, 알코올성 지방간의 산화 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시판되고 있는 글루타티온 고함유 효모 추출물(GYE)과 본 실험실에서 분리한 글루타티온 고함유 효모 FF-8GY을 비교실험 하였다. FF-8GY 또는 GYE 투여에 의한 간 조직 중의 산화스트레스 측정지표로서는 과산화지질(TBARS) 및 글루타티온 함량을 측정하였다. TBARS 농도는 간 조직 homogenize 분획에서 알코올 투여 대조군에 비해 FF-8GY 투여 실험군에서 5%수준에서 유의적으로 감소하였으며, GYE 투여에 의해서는 감소경향을 보였다. 간 조직 microsomal 및 mitochondria 분획에서도 같은 경향이 관찰되었다. 이때 간 조직 중의 글루타티온 농도는 정상군 보다 알코올 투여 대조군에서 5%수준에서 유의적으로 감소하였으며, 이러한 감소는 GYE 투여에 의해 더욱 감소되었으나 FF-8GY 투여에 의해서 정상군 수준까지 회복되는 것으로 나타났다. 한편 간조직의 손상정도를 나타내는 또 하나의 지표인 혈청 총단백질 및 알부민 농도는 알코올 처리 대조군에서 낮게 나타난 반면 FF-8GY 투여에 의해 정상군 수준 이상으로 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 글루타티온 고함유 효모 Saccharomyces cerevisiae FF-8 균체(FF-8GY)의 투여에 따른 알코올성 유발 산화스트레스의 경감 효과는 시판되고 있는 글루타티온 고함유 효모 추출물 보다 더욱 현저한 개선 효과가 있는 것으로 확인되었다.
석유에 효모를 길러 식량 내지 사료로 이용할것을 목적으로 전국 각지의 100여점의 토양시료로부터 400여주의 탄화수소이용 효모균주를 분리하고 그 중 가장 균체수율이 좋은 균주를 선정하여 동정 하였다. 그 균주의 석유탄화수소 배지에서의 배양최적조건, 생육경과 및 균체조성을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 우수균주로 신정된 효모는 Candida curvata-SNU 70으로 동정되었다. 2. 선정호모의 적정 증식배지조성은 다음과같다 Light Gas Oil 30ml, $(NH_2)_2CO$ 400mg, $(NH_4)_2\;SO_4$ 100mg, $KH_2PO_4$ 670mg, $Na_2HPO_4{\cdot} 12H_2O$ 330mg. $MgSO_4{\cdot}7H_2O$ 500mg, $CaCO_3$ 3g, Yeast Extract 50mg, Tween 20 0.05ml, Tap Water 1000ml. 3. 선정효모의 배양조건은 pH $5.5{\sim}7.0,\;30^{\circ}C$, 및 충분한 통기조건이 적당함을 알았다. 4. 유가법은 특히 10% 이상의 고농도배양에서 효과를 보였다. 5. 선정효모, Candida curvata-SNU 70는 lag phase가 16시간 까지이고 다음 28시간까지가 대수기임을 알 수 있었으며, 대수기에서 비증식율, ${\mu}x$는 $0.22hr^{-1}$이고 doubling time은 3.2시간이었다. 6. 얻어진 최적조건에서 2일간 배양시켜 Light Gas Oil에 대한 균체수율 16.1%를 얻었으며 건조세포의 단백질함량은 48.4%였다.
청주가 가지고 있는 향기는 청주의 품질을 결정하는 요인 중의 하나이다. 청주의 향기는 발효과정 중 주로 효모에 의해서 발생하는 것으로 알려지고 있고, ethyl caproate는 향기성분 중의 하나로 esterase가 생성에 관여하고 있는 효소의 하나로 보고되었다. 반면 청주 제조에 사용되는 청주효모와 코지균은 ethyl caproate의 생성과 분해 활성을 가진 esterase를 생산하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 청주 제조 중 발생하는 ethyl Caproate의 생성에 미치는 청주효모와 코지균이 가지고 있는 esterase들의 영향을 알아보기 위하여 코지균과 청주효모의 생장 중 발생하는 ethyl caproate 합성과 분해에 관련하고 있는 esterase들의 활성 변화에 대하여 알아보았다. 청주효모가 가지고 있는 ethyl caproate 합성 esterase는 caproate에 의해서 유포되고, 분해 esterase는 ethyl caproate에 의해서 유도되지만 caproate에 의해서 저해되는 것으로 나타났다. 코지균의 ethyl caproate합성과 분해 esterase활성은 균체의 성장에 비례하여 증가하였으나 ethyl caproate 생성의 기질이 되는 caproate와 ethanol이 활성에 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 또한 코지균의 배양액에서 ethyl caproate 합성 esterase의 활성이 측정됨에도 불구하고 0.01 ppm까지 ethyl caproate를 검출할 수 있는 분석조건 하에서 배지 중의 ethyl caproate는 검출되지 않았다. 본 실험의 결과를 고려한다면 청주의 제조과정 중 생성되는 ethyl caproate는 코지균의 esterase에 의해서는 거의 생성되지 않고 당화과정 후 첨가되는 청주효모가 주로 생성하는 것으로 확인되었다. 또한 청주효모의 증식과정 중에는 효모의 생장과 더불어 ethanol이 생성되어 코지균의 생장을 억제한다. 따라서 청주제조 중 생성되는 ethyl caproate는 청주효모의 esterase에 의해 생산된 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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