본 연구에서는 흑미의 가공부산물인 흑미강으로부터 기능성 polyphenol 및 flavonoid가 새로운 추출방법인 아임계 추출법을 통해 추출되었고, 열수($80^{\circ}C$), 에탄올, 설탕용액을 이용한 기존 추출법과의 추출효율이 비교 분석되었다. 건조된 흑미강 시료로부터 polyphenols(35.06${\pm}$1.28 mg QE/g dried material) 및 flavonoids(7.08${\pm}$0.31 mg QE/g dried material)에 대한 최대 수율이 아임계 추출법($190^{\circ}C$, 1300 psi, 10 min)을 통해 획득되었으며, 이것은 기존 추출법 가운데 가장 높은 수율을 보인 에탄올 추출법을 통한 polyphenols(2.98${\pm}$0.74mg QE/g dried material) 및 flavonoids (0.58${\pm}$0.21mg QE/g dried material) 수율 대비 11.77배와 12.21배 이상 더 높은 것이었다. 추출방법에 따른 흑미강 추출물의 항산화 활성은 에탄올 추출물에서 가장 높게 관찰되었다. 그러나 흑미강 시료 1g 당 획득된 추출물의 건조중량 차이 비교를 통해서 얻어진 건조 흑미강 1g 당 함유된 항산화 성분의 상대수율(relative yield, %)은 최적조건($190^{\circ}C$, 1,300 psi, 10 min)의 아임계 추출법을 통해 획득된 추출물에서 가장 높았으며, 이것은 에탄올 추출물의 항산화 성분 상대수율에 비해 대략 11.53배 이상 더 높은 것이다. 이상의 결과들은 아임계 추출법이 흑미강으로부터 기능성 polyphenols 및 flavonoids를 추출하는데 매우 적합한 방법임을 설명하고 있으며, 유기용매 추출법을 포함한 기존의 전통적 추출법에 대한 매우 효과적인 대안임을 제시하고 있다.
세닥산은 pyrazole carboxamide계 살균제로 광범위한 곰팡이 병원균을 억제하는데 효과가 있으며, trans-isomer와 cis-isomer 두 종류의 입체이성질체를 포함하고 이들은 유사한 독성학적 특징 및 살진균 활성을 가지고 있다. 세닥산의 잔류물의 정의는 농산물에서 미국(EPA)과 일본(JFCRF)에서 시스와 트랜스 이성질체의 합으로, 코덱스(Codex)와 유럽(EC)에서 모화합물로 설정되어 있다. 세닥산은 국내의 경우 2018년 수입식품 중 감자에 대한 잔류허용기준 신설이 최초 요청되었으며 국내 유통 농산물 중 잔류량에 대한 안전관리 확보를 위해 잔류물의 정의를 모화합물로 규정하고 적부판정을 위한 공정시험법을 개발하고자 하였다. 세닥산의 물리 화학적 특성을 고려하여 아세토니트릴을 이용하여 진탕추출 후 실리카 카트리지를 이용한 정제 조건을 확립하여 LC-MS/MS를 이용한 시험법을 확립하였다. 세닥산의 결정계수($r^2$)는 0.99 이상으로 높은 직선성을 보여 주었고, 검출한계 및 정량한계는 각각 0.001, 0.005 mg/kg으로 높은 감도를 나타내었다. 대표 농산물 5종(현미, 감자, 대두, 감귤, 고추)에 대하여 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배 수준으로 회수율 실험한 결과 평균 회수율(5반복)은 74.5-100.8%이었으며 분석오차는 12.1%이하로 정확성 및 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구는 국제식품 규격위원회 가이드라인(Codex Alimentarius Commission, CAC/GL 40)의 잔류농약 분석 기준 및 식품의약품안전평가원의 '식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)'에 적합한 수준임을 검증하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 농산물 중 잔류할 수 있는 세닥산 안전관리를 위한 공정시험법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 기존 식품첨가물 분석법에서 합으로써 분석되는 락색소를 laccaic acid A, B, C, E 4가지 성분으로 분류하고 개별적으로 정량 할 수 있는 분석법을 확립하였다. Natural red 25를 사용하여 구조적으로 비슷한 laccaic acid A와 B를 1차적으로 분취한 후 2차로 A와 B를 분리했다. 같은 방식으로 C와 D를 1차, 2차에 걸쳐 각각의 개별 표준품으로 사용하였다. 락색소 불검출 시료 3가지 시료(햄, 토마토 주스, 고추장)를 확보하여 0.05-107.2 ㎍/mL 범위에서 결정계수(r2) 0.995 이상의 직선성을 확인하였다. 3가지 시료에서 정밀도와 정확성을 측정한 결과, 일내 정밀도는 0.2-12.3%, 정확도는 90.6-112.7% 범위 내에서 확인되었으며 일간 정밀도는 0.3-13.3%, 정확도는 90.3-113.0% 범위내로 확인 되었다. 락색소를 사용하는 식품과 사용 금지 식품에 대해 회수율을 측정한 결과, 사용 가능 식품에서는 91.6-114.9% 범위의 회수율을 보였으며, 사용 불가 식품의 경우 92.5-113.5% 범위의 회수율을 보였다. 락색소의 검출 한계는 3가지 시료에서 검출한계 0.01-0.15 ㎍/mL, 정량한계 0.02-0.47 ㎍/mL로 확인되었다. 락색소의 4가지 성분중 laccaic acid A와 C에 대한 측정 불확도를 산출한 결과, laccaic acid A의 측정 불확도는 13.65±0.39 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2), laccaic acid C의 측정 불확도는 4.19±0.39 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2)로 비교적 낮은 측정불확도 값을 산출하였다. 따라서 본 연구에서는 식품 중 락색소의 개별 분석과 정성 및 정량분석을 위해 유효성이 검증된 분석법을 확립으로 식품 중 잔류물질 기준규격 설정 및 관리에 참고 자료가 될 수 있고, 향후 매트릭스 효과에 따른 laccaic acid 개별 분석과 개별 활성 및 독성시험 연구의 근거 지표가 될 수 있다고 판단된다.
마비성 패류 독소(Paralytic shellfish poisoning, PSP)는 유해 조류에 의해 생성되며, 독소에 노출된 수산물을 섭취하였을 때 중독이 발생한다. 수산물 중 PSP를 검출하는 표준 시험법인 Mouse bioassay (MBA)는 낮은 검출한계와 동물 윤리 문제로 대체 시험법의 개발 필요성이 대두되고 있다. 이러한 대체 시험법 중, PSP가 신경 세포막의 Na+ 채널을 차단하는 기전을 이용한 마우스 뇌신경 모세포종 세포 기반 시험법(Neuro-2a assay)의 표준화를 위한 노력이 대두되고 있다. Neuro-2a assay의 원리는 Neuro-2a 세포주에 Na+/K+ ATPase 억제제인 Ouabain(O)과 Na+ 채널 활성화제인 Veratridine (V)을 처리하여 과도한 Na+ 유입으로 인한 세포사멸을 유도한 상태에서, Na+ 채널 억제제인 PSP를 처리하게 되면 Na+ 유입이 차단되어 세포가 생존하는 것을 측정하는 것이다. 본 연구에서는 PSP 검출을 위한 Neuro-2a assay를 국내 연구 환경에 맞게 다양한 매개변수를 개선하여 최적 시험법을 확립하고자 하였다. 고려한 매개변수들은 세포밀도, 배양 조건 및 PSP 처리 조건 등으로, 그 결과는 아래와 같다. 초기 세포밀도는 40,000 cells/well로, 세포 배양시간 및 처리시간은 각각 24시간으로 설정하였다. 또한 최적 O/V 농도는 500/50 μM로 설정하였다. 본 연구에서 PSP 중 Saxitoxin (STX)에 대해서 O/V 처리가 된 상태에서 S자형 용량-반응 그래프가 도출되는 8가지 농도(368~47,056 fg/μl)를 확인하였고, Neuro-2a assay의 실험실 간 변동성 비교를 통해, 실험의 적정성 확인을 위한 5가지 Quality Control Criteria와 실험 데이터의 신뢰가능 범위(Data Criteria) 6가지를 설정하였다. 확 립된 조건으로 Neuro-2a assay를 진행한 결과 반수영향농도(EC50) 값은 약 1,800~3,500 fg/μl로 나타났다. 실험실 간 변동성 비교 결과, Quality Control Criteria 값 및 Data criteria 값의 변동계수(coefficients of variation (CVs))가 1.98~29.15% 범위로 산출되어 실험의 적정성 및 재현성이 확인되었다. 본 연구를 통해 우리나라에서 활용할 수 있는 PSP 검출용 Neuro-2a assay 시험법의 최적 조건 및 5가지 Quality control 기준을 제시하였고, PSP 중 대표적인 독소인 STX을 대상으로 Neuro-2a assay를 실시한 결과 유의한 EC50 값을 산출할 수 있었으며, 향후 국내 수산물을 대상으로 MBA를 대체할 수 있는 PSP 검출법으로 활용될 것으로 기대된다.
Dichlorprop(DCPP)는 phenoxyalkanoic acid계열로서 인체에 유해한 것으로 알려진 fenoprop, 2,4-D 및 daminozide의 대체 약제로 사용되어온 auxin 활성 생장조정제로 과수의 낙과 방지에 이용된다. 하지만, DCPP의 과다 사용은 과실의 숙기를 촉진시키며 연화 및 저장력을 현저히 저하하는 부정적인 영향을 나타내며, 제초제의 특성을 나타내기 때문에 농산물에 과다 사용하여 잔류허용기준을 초과할 경우, 인체에 유해할 수 있다. 따라서 본 연구는 생장조정제로 사용되고 있는 DCPP에 대하여 국내에 유통되는 농산물을 대상으로 잔류 실태 조사 연구를 실시하고자 기존 식품공전 분석법을 개선하여 신속하고 효율적인 분석법으로 재확립 하였다. 분석법 검증에 사용된 시료는 농산물의 메트릭스를 대표할 수 있는 농산물 5종(감귤, 감자, 고추, 대두 및 현미)을 사용하였다. 검체에 아세톤을 가하고 산성화시켜 추출한 후 산-염기 액-액 분배법을 이용해 추출, 정제 및 농축 과정을 거쳤다. 농축에 의해 얻어진 잔류물은 메탄올로 재용해한 후, 이중 2 mL를 취해 $BF_3$-메탄올 용액으로 메틸화한 후, 헥산 및 5% 염화나트륨을 사용해 최종 정제를 거친 용액을 헥산으로 재용해하여 GC/ECD에 주입하였다. 기기분석은 DB-17 중간 극성 칼럼과 운반 기체로 질소 가스를 사용하였고, split-less 모드 하에 $1{\mu}L$를 주입하여 승온 조건으로 ECD에 의해 측정하였다. 또한, GC/MS를 통해 확인시험을 수행 하였으며, 모든 검증은 CAC 가이드라인(CAC/GL 40, 1993) 규정에 따라 실시하였다. 그 결과, DCPP의 정량 한계는 모든 검체에서 0.05 mg/kg 수준이었고, 회수율은 감귤89.5-94.3%, 감자 79.4-87.4%, 고추 90.5-102.2%, 대두 78.8-101.1%, 현미 90.5-100.4%였으며, 변동계수는 감귤 2.5-9.5%, 감자 1.4-2.6%, 고추 2.7-3.9%, 대두 3.4-7.3%, 현 미 1.2-2.1%로 나타났다. 이상의 결과는 국제식품규격위원회 가이드라인 규정(CAC/GL 40, 1993)에 만족하는 수준으로, 새롭게 개선된 DCPP 분석법은 향후 국내 유통 농산물을 대상으로 한 생장조정제 DCPP의 잔류 실태 조사 연구에 활용될 계획이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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