형질전환 식물체를 직접 이용하기에는 후대에 유전적인 고정 및 포장검정이라는 문제가 대두되는데, 이를 해결하기 위하여 본 연구는 바스타저항성 유전자가 도입된 벼와 직파적 응성 계통을 교잡한 후 약배양에 의한 형질전환체 고정 등 기존 육종체계와 연계하여 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다. 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Ds15(Ba $r^{R}$)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 $F_1$을 양성하고, 이들을 PCR분석으로 제초제 저항성 유전자 bar도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1,508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 ( $A_2$)에서 채종하였다. 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고,2002년에 동진벼 Ds15 (Ba $r^{R}$)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. 결과적으로 형질전환체를 이용하여 교배부터 계통선발까지 3년 만에 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 생력육종체계가 확립되었다.
엽록체 small HSP의 기능을 조사하기 위하여 벼로부터 분리한 엽록체 small HSP를 구성적으로 발현하는 형질전환 식물체를 제작하였다. 먼저 고온 스트레스 조건하에서의 형질전환 식물체의 내열성을 chlorophyll 형광으로 측정하여 분석하였다. Leaf disc를 고온 스트레스 조건에서 5분간 처리한 후, 광화학계 II의 불활성화를 나타내는 Fo 값과 증가치를 조사하였다. 형질전환 식물체는 고온 스트레스 하에서의 Fo 값의 증가가 현저하게 감소하였다. 또한 무균적으로 Petri dish에서 재배한 유식물체를 치사온도인 $52^{\circ}C$에서 45분간 처리한 후, $20^{\circ}C$ 에서 계속적으로 배양하였을 때, wild-type 식물체는 전부 고사하였으나, 형질전환 식물체의 약 80%는 정상적으로 생존하였다. 또한 과발현된 Oshsp26 단백질의 축적량이 많을수록 내열성의 정도도 증가하였다. 이러한 결과는 엽록체 small HSP가 고온 스트레스 하에서 광합성기구를 보호함으로서 식물체의 내열성을 증가시키는데 있어서 중요한 기능을 담당하고 있음을 나타낸다.
Protox 유전자를 형질전환하여 protox 저해 제초제에 대한 내성이 증가한 벼를 모품종인 동진벼와 다른 벼 품종인 일품벼, 추청벼, 온누리벼와 같이 충북 청원, 경기 수원 그리고 전남 광주에 있는 형질전환 작물 격리포장에서 재배하면서 포장에서 발생하는 다양한 식물병을 조사하여 식물병원균에 대한 감수성 정도를 비교하였다. 충북 청원 포장에서는 벼 도열병, 깨씨무늬병, 잎집무늬마름병, Fusarium 마름증상 등이 발생하였다. 하지만 수원 포장에서는 깨씨무늬병이 거의 발생하지 않았고, 다른 포장에서 볼 수 없었던 이삭누룩병의 발생이 CCPO6벼와 온누리벼에서 0.28%와 0.37%의 발병수율을 보였다. 광주 포장에서는 깨씨무늬병의 발생이 다른 병보다 심하게 나타났다. 하지만 모든 포장에서 Fusarium에 의한 마름증상을 제외하고 벼 품종간에 있어서 발생량에 차이는 보이지 않았다. Fusarium에 의한 마름증상은 다른 벼 품종보다도 제초제를 처리하거나 처리하지 않은 CCPO6벼에서 높은 발병주율을 보였다.
동화산물의 분배 효율 개선을 통한 생산성 향상 가능성을 조사하고자 감자의 sucrose 수송자 유전자를 벼에 형질전환 하였다. 동진벼로부터 유도된 callus를 감자의 sucrose 수송자 유전자가 도입된 A. tumefaciens LBA 4404와 공동배양한 후, 선발배지에서 증식된 callus를 250 mg/L carbenicillin, 2 mg/L kinetin, 0.1 mg/L NAA가 첨가된 MS 배지에 옮겨 약2주 후부터 소식물체를 얻었다. Carbenicillin 250 mg/L 첨가된 MS 기본 배지에서 소식물체의 발근을 유도하여 재분화 식물체를 얻었다. 선발된 callus는 약 150%의 높은 식물체 재분화율을 보였다. 재분화 식물체에 대한 PCR 분석을 수행하여 감자의 sucrose수송자 유전자가 삽입된 형질전환 벼 식물체를 선발하였다. 선발된 형질전환 식물체에 대한 Southern blot 분석을 통하여 외래유전자인 감질 sucrose 수송자 유전자가 벼 genome 내에 안정적으로 도입되었음을 확인하였다.
전남대 잡초학연구실은 유전공학기술을 이용하여 수확량을 최고 26%까지 증산할 수 있는 다수확성 벼를 개발하는데 성공하여 화제를 모으고 있다. 이번에 개발된 다수확 형질전환 벼가 상용화되면서 현재 5백만톤 수준의 우리나라 벼 생산량이 7백만톤까지 늘어나게 된다. 구자옥교수가 1978년 부임하면서 개설된 잡초학연구실은 제초제연구, 제초제 저항성 잡초종의 생리생태에 대한 연구, 제초제 저항성 벼품종 개발사업 등을 진행하고 있다.
본 연구는 Protox 제초제내성 벼 재배가 토양 미생물에 미치는 영향과 수평적 유전자 이동성을 알아보기 위해 수행되었다. 생육단계별 토양 미생물 군집밀도의 경우 제초제내성 벼를 재배한 근권 토양 미생물 군집밀도가 비 형질전환 벼의 근권 토양과 유사하여 제초제저항성 벼 재배가 근권 토양 미생물에 미치는 영향은 비슷할 것으로 추정되었다. 근권 토양의 우점 미생물 분포 양상을 분석한 결과, Proteobacteria, Firmicutes와 Actinobacteria 순으로 나타났으며 우점종과 점유율은 거의 유사하였다. 근권 토양 DNA에 대한 DGGE 분석 결과, 제초제내성 벼와 비 형질전환 벼의 근권 토양 미생물 군집의 profile 변화는 나타나지 않았다. 제초제내성 벼 재배에 따른 토양 화학성을 분석한 결과, 비 형질전환 벼의 근권 토양간 화학성은 차이가 없는 것으로 나타났다. 제초제 내성 벼에 도입된 유전자군을 대상으로 근권 토양 DNA에 대한 PCR 분석 결과, 도입 유전자의 잔존성이 길지 않아 수평적 유전자 이동성은 희박할 것으로 추정되었다.
벼에서 분리한 저분자량 HSP 유전자 (OsHSP17.9)를 오차드그래스 (orchardgrass)에 도입하기 위하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 실시하여 다음의 결과를 얻었다. 오차드그래스의 종자유래의 캘러스를 OsHSP17.9 유전자가 도입된 Agrobacterium EHA101과 공동배양한 다음, hygromycin 선발된 캘러스로부터 hygromycin 저항성 식물체를 얻었다. PCR 및 Southern blot 분석 결과, 벼의 저분자량 HSP 유전자가 재분화된 식물체에 안정적으로 도입되었음을 확인하였으며, 품종 간의 형질전환 효율은 '포토맥'의 경우 16.5%, '프론티어' 의 경우 8.0%를 나타내었다. 또한 Northern blot 분석 결과, 도입된 유전자가 형질전환체에서 정상적으로 발현된다는 것을 확인하였으며, 형질전환체의 계통 간에 발현량의 차이를 나타내었다.
1. 본 연구에서는 공동배양 배지에 Agrobacterium 성장 억제물질인 silver nitrate를 첨가하고 변온과 여과지처리를 추가하여 공동배양 기간을 7일로 늘였으며, 또한 항산화 물질 3종을 공동배양 배지에 첨가하여 세포의 oxidative burst를 최소화함으로써 벼 형질전환효율을 높일 수 있었다. 또한 이 방법을 적용하여 형질전환이 어려운 품종을 대상으로도 형질전환 식물체를 작성할 수 있었다. 2. 벼 형질전환체의 70%에서 도입유전자 수가 1copy인 것으로 나타나, 적은 수의 유전자가 안정적으로 도입됨을 확인 하였다. 3. 이러한 결과를 바탕으로, 새로운 공동배양 방법을 사용하여 우수한 농업적 형질을 가진 벼 육종 소재 및 품종을 신속하게 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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