누에의 卵形成時期동안 자성 혈림프에서 DEAE-cellullose column을 使用하여 vitellogenin을 순수하게 分離해 낸 후, 電氣泳動法과 免疫學的 方法을 使用하여 각 器官에 따른 vitellogenin의 分布와 이의 量的 變化를 調査하였다. 누에의 vitellogenin은 난성숙시기에 걸쳐 혈림프, 脂肪體 및 卵巢에 모두 分布하고 있으며, 특히 포화후 7일까지만 확인되었으며 그 이후 급격한 量的 減少를 나타내었으며, 또한 血蛋白質은 卵巢蛋白質과 最小한 3개의 同質인 蛋白質을 갖고 있는 것으로 보아 卵形成에 vitellogenin 이외의 다른 血蛋白質도 관여 되는 것 같다.
매미나방 종령유층 혈림프내에 존재하는 JHBP을 Dextran Coated Charcoal (DCC)binding assay와 gel filtration에 의해서 확인하였고, JHBP의 pI값은 5.3으로 밝혀졌다. JHBP의 정저는 혈림프단백질을 먼저 PEG로 침전시킨 후 ion exchange chromatography와 gel filtration 방법을 통하여 행하였다. 정체된 fraction의 JH에 대한 binding activity는 [3H] JH-III의 radioactivity 측정과 DCC binding assay를 통해 확인하였고, 정체된 단백질의 순수도는 각 정체단계에 따라 전지영동을 하여 확인하였다.
배추흰나비의 전용기 혈림프에서 $\beta$-N-Acetylglucosaminidase를 DEAE-cellulose ion exchange 및 Sephadex G-200 column chromatography 법을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소는 7% acrylamide gel 전기영동에서 단일 band를 나타내었으며, 당을 함유한 복합단백질이었다. 최적 pH는 5.0, 최적반응온도는 6$0^{\circ}C$이었으며, 각 온도에서 10분간 incubation한 열안정성에 있어서는 6$0^{\circ}C$까지 비교적 높은 활성을 나타내었지만 7$0^{\circ}C$ 이후에는 거의 활성을 나타내지 않았다. 또한 Hg$^2$+ 처리는 심한 효소활성의 저해 현상을 보였지만, Mn$^2$+, $Mg^2$+ 등은 활성의 증가를 나타내었으며, Km 값은 6.67$\times$10-$^3$M, pl 값은 5.8, 분자량은 4.1$\times$105 daltons 이었다.
세크로핀(cecropin)은 곤충의 체액성 면역에 있어서 효과적인 방어인자로 작용하는 항균 펩타이드로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 면역 유도된 천잠, Antheraea yamamai 유충 혈림프로부터 세크로핀 항균 펩타이드 분리 및 정제를 실시하였다. 먼저 항균 펩타이드를 분리하기 위해서, 면역 유도된 유충 및 정상 유충으로부터 추출된 혈림프 단백질 시료에 대한 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 통하여 비교분석하였다. 정상누에 혈림프 시료에 비해 면역 유도된 혈림프 추출물에서만 특이적으로 발현되는 분자량 4,223.01 Da의 펩타이드 밴드를 검출하였다. 선발된 면역유도 특이적 발현 펩타이드의 특성 분석을 위해서 이온교환 크로마토그래피 및 gel permeation 크래마토그래피을 수행하여 특이적으로 발현되는 펩타이드를 성공적으로 순수 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Edman degradation법으로 N말단 아미노산 서열을 결정하였고 다른 나비목곤충의 세크로핀과 매우 높은 상동성을 나타내어 세크로핀으로 동정하였다. 또한 정제된 천잠 세크로핀 항균 펩타이드는 그람음성세균, 그람양성세균 및 곰팡이에 대해 폭 넓은 항균 스펙트럼을 나타냈었다.
작잠 arylphorin 항 혈청을 사용하여 천잠, 가중나무 산누에 나방 및 옥색긴꼬리 산누에나방의 5령 유충의 혈림프, 피부, 지방체, 중장 및 실샘에 대한 종(species) 공통항원의 존재 여부를 비교${\cdot}$검토하였다. 4개종은 혈림프, 피부, 지방체, 중장 실샘 등 종별 조직에 따라 다소간 검출유무의 차이는 있으나 작잠 arylphorin 항 혈청에 대한 공통항원의 존재는 4종의 야생곤충 모두에서 확인되었으며, 특히 혈림프에서 가장 강력한 항원-항체 반응이 관찰되었다. 이상의 결과에서 A. pernyi arylphorin은 천잠 등 4개의 공시곤충들의 공통 조상유전자로부터 유래한 단백질일 가능성이 높은 것으로 사료된다.
누에의 5령유충 섭식기 동안 절식, 두흉부 결찰, 재섭식 및 methoprene 등의 처리가 JHE 활성도의 조절에 미치는 영향을 실험한 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 누에의 절식 및 결찰처리를 하면 혈림프 JHE 활성도가 감소하였다. 2. 절식누에는 재섭식에 의해 JHE 활성도가 증가하였으며, 재섭식에 의한 JHE 활성도의 증가시기는 절식기간에 따라 다르게 나타났다. 3. 절식누에에 methoprene을 투여하면 JHE 활성도는 5령 기잠과 1일에서는 변화가 없었으나 2일부터 5일에서 절식누에에 비해 1.3-1.4배 증가하였다. 4. 결찰누에에 methoprene을 처리하면 JHE 활성도는 5령 기잠에 변화가 없었고 1일부터 5일에서는 결찰누에에 비해 1.9-2.3배 증가하였다. 5. 이상의 결과에서 5령누에의 섭식기 동안 JHE 활성도의 조절에는 두부요인, JH 및 영양 등이 중요한 요인으로 작용하였다 .특히 섭식기에 있어서 JHE는 두부요인과 JH의 공동작용에 의해 조절되지만, 령의 초기에는 두부요인이 그 후에는 JH가 보다 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
곤충 혈림프에서 존재하는 리포포린은 선택적으로 지질을 지질 사용및 저장기관으로 운반한다. 본 연구는 유충지방체, 성충난소 및 정소로 지질의 운반과 유충지방체 및 성충난소로 리포포린 자체가 흡수되는 과정을 조사하였다. 이들의 기능을 조사하기 위해 FITC-labeled 리포포린과 DiI-labeled 리포포린을 사용하였다. 유충지방체, 성충난소 및 정소를 DiI-labeled 리포포린과 배양한 결과 리포포린으로 부터 각 기관으로 지질을 운반함을 알 수 있었고, 또한 receptor-mediated endocytosis 억제제인 suramin, unlabeled 리포포린과 배양한 결과는 리포포린에서 각 기관으로 운반되는 지질의 양이 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 또한, 유충지방체와 성충난소를 FITC-labeled 리포포린과 배양한 결과 위에서 언급한 지질 뿐만 아니라 리포포린 자체도 각 기관의 에너지원으로 사용하기 위해 흡수된다는 사실을 알 수 있었으며, suramin과 unlabeled 리포포린과 배양한 결과 리포포린 자체가 흡수되는 양이 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 위 실험결과로부터 리포포린에 의한 지질의 운반과정과 리포포린 자체의 흡수과정이 receptor-mediated endocytosis로 이루어짐을 알 수 있었다.
본 연구는 둥글장수풍뎅이(Pentodon quadridens bidentulus (Famaire, 1887)) 유충의 혈림프에 존재하는 혈구세포들의 종류와 병원균 침입시 세포 면역을 담당하는 세포를 특정하고 분석하였다. 둥글장수풍뎅이(P. quadridens bidentulus)유충 혈강내에는 과립혈구세포, 부정형혈구세포, 편도혈구세포, 소구형혈구세포, 원시혈구세포, 지방혈구세포 총 여섯 종류의 혈구세포들이 존재하였다. 여섯 종류의 혈구세포 중 과립혈구세포가 병원균 침입 시 형태적 변이와 함께 병원균들에 대한 식균작용을 수행하는 면역세포로 관찰 되었다. 특히, 생체 내에서 병원균 침입시 12시간 안에 활발히 식균작용을 수행하였고 24시간 이후로는 면역 활성화가 줄어들면서 정상상태로 전환되는 것을 알 수 있었다. 세포질 혈구세포의 식균작용도 간혹 관찰 되었으나 나머지 세포들은 면역과 연관된 활성화가 없는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 SDS/polyacrylamide젤 전기영동과 2차원 전기영동을 사용하여 Gerris paludum(소금쟁이)의 난 형성 동안 난소 단백질과 혈림프 단백질을 비교하였다. 또한 난물질의 구성성분인 glycoprotein의 양상을 살펴 보았다. 결과는 다음과 같다. 난을 갖지 않는 5령의 난소 단백질의 양상을 성체의 산란 무 난소 단백질 퍼턴과 유사하였다. 난 발달동안의 난소의 단백질중 M.W 66,000-110,000 사이의 단백질이 난을 갖지 않은 난소 단백질에 비해 많은 양이 존재하였다. 난을 갖지 않은 난소에서는 glycoprotein은 나타나지 않았다. glycoprotein은 5령의 난 발달이 진행됩에 따라 점차적으로 증가하였다. 산란후 성체의 난소에서는 5령의 난을 갖지 않는 난소에서처럼 glycoprotein은 나타나지 않았다. 또한, M.W 66,000-110,000 사이의 혈림프 단백질은 5령의 난 형성 동안 양적으로 증가하였다. 이러한 결과는 난소 단백질 중 일부를 혈림프로부터 얻을 것이라는 사실을 제시하는 것이다. 발달하고 있는 난의 glycoprotein은 이 단계의 혈림프에서도 점차 증가하였다. 낮은 분자 영역에서 하나의 band (M.W. 9,500)가 난을 갖지 않는 5령과 성체의 혈림프에서 분리되었다. 이 단백질은 고분자량의 영역(M.W. 66,000-110,000)에서 나타나는 glycoprotein 전구체라고 생 각된다. 2차원 전기영동에서는 난을 갖지 않은 난소 단백질이 난을 가지고 있는 난소 단백질에 비해 적은 spots로 분리되었고 그 양도 적었다. M.W 45,000-110,000 사이의 band들은 2차원 전기영동에서 산성쪽으로 분리되어 나타났다. 특히, M.W. 102,000의 분자량을 가지는 band는 4개의 spots bl, b2, b3 및 b4로 분리되었다. 반면에 M.W 24,000이하의 단백질들은 산성쪽의 단백질보다 염기성쪽으로 분리되었다. Gepris paludum의 난황 형성과정에 있어서 세포내 기관(= 세포 소기관)의 기작이 난세포의 난황단백질 합성과 관계를 가지고 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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