미립자병을 진단하기 위한 방법으로 1972년에 면역형광염색법을 적용한바 있으나 항원취급의 위험성 때문에 병원체를 -5$^{\circ}C$, -4$0^{\circ}C$ 및 -8$0^{\circ}C$에 불화화 시킨후 항원으로 사용할 경우 그 항원 설을 검토한바 저온처리 되지 않은 항원과 동일한 항원성을 나타내어 발표코저 한다.
난백에 NaOH, 열, 및 효소를 처리하였을 때, 난백 중의 ovomucoid(OM) 및 ovalbumin(OA)의 항원성 변화를 항OM 및 항OA 항체를 이용하여 간접경합 ELISA로 조사하였다. 효소처리는 OM의 항원성을 효과적으로 감소시키지 못한 반면 OA의 항원성은 식물성, 미생물성 protease를 사용하였을 때 약 1/5,000-1/100,000로 감소되었다. 열처리를 한 난백 중 OM은 $100^{\circ}C$까지 거의 변화하지 않으나 $121^{\circ}C$ 처리에서는 난백의 항원성이 OM은 1/250으로 감소되었다. OA의 항원성은 열처리에 의해 오히려 증가되었으며 최고 100배까지 증가되는 것으로 나타났다. NaOH를 농도별로 처리한 난백 중 OM의 항원성 변화는 0.3%부터 감소하기 시작하여 1%이상에서 항원성이 거의 제거되었다. 반면 OA의 경우는 모든 NaOH 처리농도에서 항원성이 증가하였다. NaOH 처리에 추가적인 열처리($70^{\circ}C$, 15분)를 실시한 것은 난백중 OM과 OA의 항원성 감소에 다소 효과적인 것으로 나타났다.
여러 가지 처리가 난백의 항원성을 감소시키는데 미치는 영향을 조사하기 위하여, 토끼 항난백항체로 난백 처리물들의 간접 경합 ELISA(ciELISA)를 실시하였다. 식물성, 동물성, 미생물성의 9가지 효소를 이용한 가수분해처리는 난백의 항원성에 영향을 주지 못했다. 보다 효율적인 효소 가수분해를 위해 방사선 조사 후, 효소처리를 실시했는데, 이것 역시 항원성을 감소시키지 못했다. Trifluoromethanesulfonic acid 처리는 난백의 항원성을 거의 제거시키는 것으로 나타났다. 열처리는 $121^{\circ}C$ 고온처리의 경우에서만 반응성이 1/10,000이하로 감소하여 항원성이 거의 사라졌다. NaOH 단독 처리는 0.3%(w/v) 이상의 농도에서 반응성이 감소되기 시작하여, 1%(w/v) 이상에서는 반응성이 1/10,000이하로 감소하였다. NaOH 처리에 $70^{\circ}C$, 15분간의 열처리를 더해 주면, NaOH 단독 처리시보다 효과적으로 항원성이 감소되는 것으로 나타났다.
폐흡충(Paragonimus westermani)이 숙주의 폐조직 내에서 성숙하는 동안 숙주에게 항체생성을 유도하는 물질의 폐흡충 충체조직내 분포하는 부위와 성숙하는 동안 숙주가 생성하는 항체의 면역반응 정도를 확인하기 위하여 폐흡충 피낭유충을 실험고양이에 감염시키고 발육단계 별 충체와 면역항체를 얻어 조직항원과 면역항체를 반응시켜 환금입자를 표지하였다. 황금입자가 표지된 조직 항원을 전자현미경으로 관찰하고 황금입자의 밀도에 따라 조직성분의 항원성을 측정한 결과 감염군 면역항체를 반응시킨 경우 숙주체내에서 4 주 동안 성숙한 유약성충 조직항원은 표피충의 표피합포체에 높은 밀도의 황금입자가 표지되어 항원성이 강한 것으로 관찰되었다. 8 주 이상 성숙한 충체부터 조직항원은 표피충에 환금 입자의 표지가 현저하게 감소하여 12 주 이상 성숙한 충체 표피층은 항원성이 미약한 것으로 관찰되었다. 12 주 이상 성숙한 충체는 난황세포의 구성물질들에 각각 항원성이 특이하게 나타나며 유연조직의 분비과립과 맹관 그리고 배설낭의 구성 물질들은 충체의 성숙정도에 상관없이 항원성을 포함하고, 숙주가 생성하는 항체는 감염 후 12 주부터 16 주사이에 항체생성이 극대 화되는 것으로 생각되었다.
기니픽과 New Zealand White Rabbit에서 PDT-Hepa에 대한 항원성 시험을 실시하였다. 1) Active Systemic Anaphylaxis (ASA), 2) Passive Systemic Anaphylaxis (PSA), 3) Passive Custaneous Anaphylaxis (PCA) 시험을 실시한 결과 ASA, PSA 실험에서 anaphylaxis와 관련된 어떠한 특이적인 임상증상도 나타나지 않아 PDT-Hepa는 기니픽과 토끼에서 항원성이 없는 것으로 보인다. 또한 PCA 실험에서 청색반점이 관찰되지 않은 것으로 보아 PDT-Hepa specific IgE는 생성되지 않는 것으로 판단된다.
본 실험은 H-Y 항원 유전자 크로닝을 위한 기초연구로서 H-Y 항원의 특성을 규명하기 위하여 친화성 크로마토그래피에 의하여 H-Y 항원을 분리·정제하였다. 정소 추출액을 항체가 결합된 column에 결합시킨 뒤 10% acetic acid로 용출시켰다. 용출된 분획을 모아 농축한 후 HPLC와 SDS-PAGE를 실시하여 H-Y 항원의 분자량은 약 6,7000달톤 임을 알 수 있었으며 isoelectric focusing에 의하여 등전점(pI)은 5.0인 것으로 측정되었다. H-Y 항원에 대한 단일클론항체와 표지항원으로는 H-Y 항원-ABEI(aminobutylethyl isoluminol)를 사용하여 H-Y 항원 정량을 위한 화학발광면역분석법을 개발하였다. 항원항체 반응후 빛의 측정은 NaOH 존재하에서 microperoxidase/H2O2를 이용한 산화반응으로 실시하여 10초간 측정한 빛의 양을 적분하였다. H-Y 항원의 농도와 빛의 양과는 역비례하였으며 감도는 11.8ng/tube 정도이었다.
폐흡충 성충 표피의 구성 단백질의 분자량을 측정하고. 항원성을 갖는 표피 단백질을 규명하였다. 10개월 성충을 0.1% digitonin용액에 담궈 표피하 기저 막까지 박리하여 회수한 표피층을 초음파 분쇄하여 표피 단백질을 추출하였다. 표피 단백 질 추출액을 SDS-PAGE와 immunoblot으로 분석하였다 폐흡충 표피의 구성 단백질은 분자량이 각각 94. 74 (76-66). 62. 54. 44. 42. 38, 28, 26, 25 24. 17. 15.5. 13.5 IEDa으로 측정되었고. 94 kDa 단백질이 가장 주된 표피단백질이었다. 폐흡충 감염자 혈청을 사용한 immunoblot에서 항원성이 확인된 표피단백질의 분자량은 각각 94. 90. 78. 76. 74. 68. 65. 62. 60, 59. 54 kDa 이었다. 이 표피항원 단백질은 폐흡충증 혈청 10개중 7개에서 immunoblot 양성반응을 나타내었고. 7개 양성반응 혈청 각각에서 표피항원 단백질의 특이 항원성이 모두 관찰되었다. 그러나. 이들 폐홉충 표피항원은 간흡충란 양성자혈청과는 전혀 반응하지 않았다. 이상의 결과로. 폐흡충 표피 단백질중에서 분자량 94-54 kDa 사이의 것들이 폐흡충 특이 항원임을 알 수 있었고. 특히 94 kDa 단백질은 가장 양이 많은 대표적인 표피단백질이면서 아울러 특이항원성도 갖고 있었고. 양이 적은 표피단백질이었던 76. 66 kDa 단백질도 상대적으로 높은 특이 항원성을 보여주고 있음을 확인할 수 있었다.
간흡충의 항원성 부위를 규명하기 위하여 간흡충 충체로부터 분리한 체액을 실험 토끼에 주사하여 면역시킨 IgG와 간흡충에 감염된 실험 토끼의 IgG를 간흡충 조직 항원에 반응시키고 면역황금 표식법을 이용하여 전자현미경으로 관찰한 바 그 결과는 다음과 같다. 간흡충의 조직세포 사이의 구성물인 세포간질과 맹관의 내용물, 그리고 맹관 막 구조물은 충체에 감염된 IgG와 체액 항원에 면역된 IgG 모두에서 항원-항체 반응이 관찰되었지만 체액 항원으로 면역된 IgG에서 다소 강한 반응이 나타났다. 표피의 기저층과 난황선의 난황 물질은 충체에 감염된 IgG에서는 반응이 나타나지 않았으나 체액 항원에 면역된 IgG에서는 강한 반응이 나타나 이들을 구 성하는 물질은 체액 반응 IgG에 대한 특이 항원으로 생각되었다. 배설관의 내용물과 막 구조물은 충체에 감염된 IgG에 대한 반응이 특이하였으나 체액 항원에 면역된 IgG에 대한 반응은 매우 미 약 하여 항원성에 차이점이 있는 것으로 생각되었다. 수정낭의 정자세포 간질은 충체 감염 IgG에 반응 하고 정자세포의 두부는 체액 항원으로 면역된 IgG에 반응하여 매우 상이한 항원성이 나타났다. 이상의 결과로 보아 충체의 세포간질과 맹관 구성물은 충체 감염시와 체액 항원에 면역된 IgG에 대하여 반응의 정도 차이는 있으나 항원성으로 관찰되는 것은 동일하였다. 그러나 수정낭의 세포간질과 배설낭의 구성물질은 충체에 감염된 IgG에 대한 특이 항원이며 수정낭 내의 정자들의 두부와 난황을 구성하는 물질은 체액 면역 IgG에 대한 특이 항원인 것으로 생각된다.
폐흡충 충란항원의 항원성을 평가하기 위하여 감염 후 10개월된 충체에서 유리된 충란의 수용성 항원을 제작하였다. 실험감염 개 페흠충증에서 특이 IgG, IgM 항체의 생성을 효소면역측정법으로 충체항원과 비교 관찰하였다. 또한 disc-PAGE로 충란항원의 구성 단백질을 관찰하였다. 1. 폐흡충 충란항원에 대한 특이 IgG 항체는 충체가 충란을 형성하는 감염 8주에 상승하기 시작하여 12주에 최대치에 이르고 이후 일정한 항체가를 유지한 반면, 특이 IgM 항체의 생성은 대단히 미약하였다. 2. 폐흡충 충체항원에 대한 특이 IgG 항체는 감염 2주에 상승하여 관찰기간인 13주까지 계속 상승하였다. 항체가도 충란항원보다 높았다. 충체항원에 대한 특이 IgM 항체는 감염 2주부터 나타나 8주까지는 일정량을 유지하나 이후 감소하기 시작하여 12주에는 감염전 상황으로 되돌아왔다. 3. 폐흡충 충란항원은 전기영동상에서 단백질 band 2개로 관찰되었으며 성충의 충체항원에서 관찰되는 10개의 단백질 band중 Band 1과 Band 2에 해당되는 단백질 band임을 확인할 수 있었다. 따라서 2개의 단백질로 구성된 폐흡충의 수용성 충란항원은 특이 IgG 및 특히 IgM 항체 생산을 유도하나 성충충체항원에 비하여 그 항원성이 대단히 미약하다고 판단하였다.
본 연구에서는 우유 앨러지의 원인물질중의 하나인 casein단백질을 생체가 알르겐 물질로 인식할 수 없는 수준의 분자로까지 분해하여 항원성을 저감시키고 또한 풍미가 좋은casein분해물을 제조하기 위하여 분해특성이 다른 효소를 사용하여 만들어진 분해물의 특성과 항원성을 조사하였다. 박테리아 효소인 Neutrase, Alcalase, Protamex, Pescalase을 처리한 casein가수분해물의 평균분자량은 1,100~2,300 dalton이었고 곰팡이 효소인 MP, Flavourzyme, LP, Promod경우에는 거의 770 ~ 1,140 dalton범위였다. 항원성 저감정도를 측정하기 위하여 토끼항casein항혈청을 이용하여 ELISA억제시험을 실시한 결과 항체결합을 50%저해하는 미분해casein단백질의 농도는 $10^{3.6}$ng/ml였다. 박테리아 효소인 Neutrase, Alcalase, Protamex, Pescalase에 의한 Casein가수분해물의 값은 각각 $10^{4.8},\;10^{5.5},\;10^{5.9},\;10^{6.1}\;ng/ml$이었고, 곰팡이 효소인 MP, Flavourzyme, LP, Promod경우에는 각각 $10^{6.3},\;10^{6.3},\;10^{6.5},\;10^{6.8}\;ng/ml$로 나타났다. 박테리아와 곰팡이효소의 조합인 Fla+prota, Pro+prota처리구에서는 $10^{7.4},\;10^{7.3}ng/ml$로 나타났다. 따라서 미분해 casein의 항원성을 1로 하면, casein분해물의 항원성은 최고 1/8,000 이하로 저하되었다. 수신피부아나피랙시스반응(PCA)을 이용한 항원성시험에서 casein으로 피하 감작할 경우 푸른색 반점이 나타났으나 효소처리구에서는 이러한 반점이 나타나지 않아 충분히 항원성이 저감화 되었음을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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