본 연구는 벼종자 미량 단백질의 프로테오믹스 연구를 위하여 벼종자에 고 함량으로 존재하는 벼종자 글루테린 저장 단백질을 제거하는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 연구는, (A) 벼종자에 액체 질소를 가하고 분쇄하여 벼종자 가루를 만드는 분쇄단계; (B) 상기 분쇄된 벼종자 가루를 물에 현탁하여 현탁액을 만드는 현탁단계; (C)상기 현탁액 중 미용해 물질을 제거하는 분리단계를 포함하는, 벼종자 미량 단백질의 프로테오믹스 연구를 위한 벼종자 글루테린 저장 단백질의 제거방법에 관하여 검토하였다. 본 연구의 결과, 단순하고 신속하며 저렴하고 효율적인 방법으로 미량 비글루테린 단백질들을 용이하게 동정할 수 있을 것으로 판단되었다.
환경오염이 심각해짐에 따라 국내외적으로 환경에 대한 관심이 고조되고 인체에 해를 끼치는 환경요인으로부터 방어하기 위한 많은 노력들이 기울여지고 있다. 특히 내분비계장애물질이 생식기능과 면역기능을 약화시키고, 행동 이상을 일으키며, 암 발생률을 높인다는 점이 밝혀지기 시작하면서 많은 연구들이 발표되고 여러 가지 방법들이 내분비계장애물질과 더불어 환경분야연구에 응용되어왔지만 단백질을 대상으로 연구하여 유전자기능을 연구하는 프로테오믹스(proteomics) 연구를 접목시키려는 시도가 아직까지는 빈약하다. 프로테오믹스는 기능을 갖는 단백질들의 발현을 종합적이고 정량적으로 측정하는 가장 직접적인 수단이고, 질병, 약물투여, shock 등 생물학적인 동요(perturbation)에 의하여 변하는 단백질들의 발현양상의 변화를 정확하게 관찰할 수 있으며, 생체내 유전자발현의 궁극적인 양상을 규명할 수 있고, 또한 유전자, 단백질 및 질병간의 연결고리를 제공한다. 기존의 biomarker는 다른 질병 표지자와 연관성이 높아 직접적인 유해물질 노출 위험도를 정확히 판정하기 어렵다. 따라서 대량발굴탐색(high-throughput screen-ing)이 가능한 2차원 전기영동 분석과 MALDI-TOF 또는 protein chip array와 SELDI-TOF에 의한 단백질 분자구조 분석기술 및 이들을 지원하는 생물정보학(bio-informatics)의 발전을 이용하여 환경독성 연구에 이용 할 수 있는 표적단백질(biomarker)발굴에 적절한 이용이 가능할 것이다.
최근 프로테오믹스 분야에서 단백질의 추출, 분리기술의 발전과 고성능 질량분석 장비로 인하여 대량으로, 또 빠르게 샘플을 분석하는 것이 가능해짐에 따라서, 한번의 실험으로부터 얻어지는 실험데이타의 양이 대폭 늘어나게 되었다. 따라서 대량의 데이타를 어떻게 처리하여 필요한 정보만을 얻어내는가가 큰 이슈가 되고 있다. 하지만 기존의 데이타 해석과정은 불필요하게 계산자원을 낭비하는 요소를 상당 부분을 포함하고 있고, 이로 인해 데이타 해석 시간이 증가함은 물론, 종종 옳지 않은 해석 결과를 생성함으로써 결과에 대한 신뢰도의 저하를 초래했다. 본 논문에서는 기존의 데이타 해석 과정에서의 문제점을 지적하고, 데이타 처리의 효율을 높임과 동시에 해석 결과의 신뢰도를 제고하기 위한 SIFTER 시스템을 제안한다. SIFTER 시스템은 본격적인 데이타 해석에 앞서, 질량 스펙트럼의 질을 평가하고 하전량을 결정하는 소프트웨어를 제공한다. 탠덤 질량 스펙트럼에 나타나는 단편 이온의 특성을 고려하여 스펙트럼의 질과 하전량을 정확하게 결정하는 방법을 제공함으로써, 데이타 해석에 앞서 스펙트럼의 질이 낮아 해석이 불가능할 것이 분명한 경우 이들을 미리 제거하고 스펙트럼 해석과정에 잘못된 정보가 사용되지 않도록 한다. 결과적으로 데이타 해석과정에서의 효율과 해석결과의 정확성에 있어 대폭적인 개선을 기대할 수 있다.
인간 게놈프로젝트가 거의 완성되어 감에 따라서 해독된 유전자의 암호를 바탕으로 기능을 밝히는 연구가 많이 진행되고 있다. 그중에서 디스플레이 프로테오믹스에 관한 연구가 주목을 받으면서, 세계적으로 2-DE 데이터베이스가 많이 구축되었다. 이 데이터베이스를 구축하기 위해서는 자동화된 구축도구가 필요한데, 이 도구를 개발하기 위해서는 데이터베이스 통합이 필수적으로 요구된다. 본 논문에서는 생물학적 실험을 통하여 얻어진 펩티드 질량으로써, 다수의 펩티드 질량검색기를 통합하여 자동으로 단백질을 인식하고, 인식된 단백질에 대한 정보를 제공하는 다수의 프로테옴 관련 데이터베이스의 통합을 통해서 2-DE 데이터베이스를 자동으로 구축하는 도구와 데이터베이스 구축결과를 제시한다.
유전자에 대한 정보를 획득하는 기술적인 문제가 해결되면서, 질병 진단을 위한 새로운 접근 방법으로 혈액 속에 있는 모든 단백질(proteome)의 구성을 분석하는 프로테오믹스(proteomics)에 대한 연구가 최근 들어 활발하게 진행되고 있다. 본 논문은 암 진단을 위하여 혈액 중의 단백질의 구성을 측정한 2차원 전기영동 (2D electrophoresis) 젤 데이터를 해석하는 새로운 방법을 제시하였다. 우선 측정된 많은 단백질 스팟(spot) 중에서 T-statistics 방법으로 단백질 스팟들을 선택하였다. 선택된 단백질 스팟들로 이루어진 암 환자와 정상인 두 샘플들의 확률 분포를 각 집단에 따로 적용된 PCA 영역에서 계산하였다. 최종적으로 조건부 확률의 차이에 근거한 베이즈 분류(Bayes classification) 이론을 적용하여 암 진단을 하였다.
최근 들어 게놈기능연구는 주요국가의 새로운 국가적 연구표적으로 지정되면서 유전자기반 생물산업의 핵심으로 부각되고 있다. 이러한 발전은인간(2001년 2월 인간 게놈의 초안 발표)을 비롯한 생물체의 게놈구조가 규명되어 이 유전자구조정보를 web상에서 쉽게 알아낼 수 있는데서 비롯된다. 포스트게놈시대의 게놈기능연구를 총괄적으로 '기능유전체학 (Functional Genomics)'이라고하며 여기에는 핵산(DNA나 RNA)을 표적으로 게놈기능을 연구하는 genomics(유전체학, RNA발현을 대상으로 하는 transcriptomics(전사체학) 포함), 총체적인 단백체를 대상으로 유전자기능을 연구하는 proteomics(단백질체학) 및 대사물질을 대상으로 하는 metabolomics(대사체학), 이들 분야를 공통적으로 지원하는 bioinformatics(생물정보학)로 구분된다. 본 고에서는 프로테오믹스 분야를 중심으로 소개하고자 한다.
The etiological agent is Bacillus anthracis, a gram-positive rod-shaped bacterium able to form spores. In order to elucidate the mechanism of infecttion on human macrophage cells, we performed two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF analysis using the infected human macrophage cells with the spores of B. anthracis Sterne of inactivated B. anthracis Sterne. We identified 9 proteins which related to the infection of Bacillus anthracis spores on human macrophage cells at the early stage events. Maybe nine proteins will be bio-markers and vaccine candidates to the Bacillus anthracis spore infection.
프로테오믹스는 세포 안 또는 개체 안의 모든 단백질을 총체적으로 연구하는 분야이다. 단백질 동정은 단백질이 어떤 아미노산의 서열로 구성되었는지를 확인하는 것이다. 하지만 Post-translational modification과 같은 단백질 변형을 고려하게 되면 단백질 동정은 매우 어렵게 된다. $MOD^i$ 알고리즘은 단백질 동정을 할 때 Post-translational modification의 종류나 개수에 제한 없이 단백질 동정을 정확하게 수행한다. 하지만, 대용량 단백질 서열 데이터베이스를 사용하면 수행시간이 많이 걸리는 단점이 있다. 본 논문에서는 $MOD^i$를 보완하기 위해 대용량 데이터베이스에서 후보 단백질을 선정하는 알고리즘을 통해서 개선된 $MOD^f$ 알고리즘을 제안하고 Target-decoy search strategy를 적용하여 정확성을 분석한다. 후보 단백질 선정 알고리즘과 Target-decoy search strategy 적용 결과 $MOD^f$는 $MOD^i$에 비해 정확도를 희생하지 않으면서 수행속도는 약 2배 향상되었다.
아스코크로린(Ascochlorin, ASC)은 Ascochyta viciae로부터 추출된 프레닐페놀 물질로, 혈청 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수치를 감소시키고 종양 성장을 억제한다는 연구 결과가 보고되어 있다. 본 논문에서는 아스코크로린이 생리학적 혹은 병리학적인 작용과 염증반응에서 약리학적으로 유도되는 반응을 어떻게 조절하며, 이러한 메커니즘에 대해 이해하기 위해 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린을 처리하여 이에 대한 프로테옴의 특이적인 발현에 대해 분석하였다. 따라서 본 연구는 LPS를 처리한 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린을 처리하여 염증과정에 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 프로테오믹스를 시행하였다. Mouse macrophage RAW264.7 세포에 아스코크로린을 처리한 조건과 무처리한 조건으로 나누어 two-dimensional electrophoresis (2-D SDS-PAGE), matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)와 bioinformatics 방법으로 아스코크로린을 처리한 mouse macrophage Raw264.6 세포의 프로테옴을 분석하였다. 그 결과 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린 처리 시 Calreticulin이 4배 감소, ${\beta}-actin$도 4배 감소 그리고 vimentin이 1.5배 감소함을 확인 할 수 있었다. 그러나 rabaptin 아스코크로린 처리에 의해 3배 증가함을 확인 할 수 있었다. 이러한 단백질 발현은 RT-PCR을 수행하여 결과에 대해 재확인 하였으며, 프로테오믹스와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 LPS 처리에 의해 활성화된 mouse macrophage RAW264.7 세포에 ASC를 처리한 후 이차원 전기영동법을 이용하여, 단백질의 발현 변화 및 양상을 규명하고 단백질 지도를 확립 하였으며, RAW264.7 세포를 이용한 면역세포 모델에서 ASC의 항염증 작용을 중심으로 생리활성 조절기능을 확인 할 수 있었다. 향후 분자 기능 조절 연구와 전 임상 연구를 통해 ASC의 생리활성 조절 기능을 규명한다면 ASC는 항염증 및 항암활성을 갖는 약물로 개발될 것으로 기대된다.
프로테오믹스에서 얻는 탄뎀 질량 스펙트럼은 효소로 가수분해된 펩타이드의 전구이온(precursor ion) 분자량과 펩타이드에 에너지를 가하여 생성된 이온조각(fragment ion)들의 분자량값들로 구성된다. 탄뎀 질량스펙트럼의 전구이온 분자량은 단백질 서열 데이터베이스에서의 검객 과정에서 가장 먼저 고려하는 값이다. 단백질 검색 프로그램은 단백질 서열 중에 스펙트럼의 전구이온으로부터 계산된 분자량과 일치하는 펩타이드 서열들을 찾아내고, 이들 중의 하나를 이온조각들의 분자량 정보를 이용해서 선택한다. 이 때에 전구이온의 분자량은 사용자가 지정한 오차범위 내에서 일치하는 감을 검색하는데, 이때의 오차범위는 질량분석기의 정확도에 따라 결정된다. 본 논문에서는 인간 혈액의 혈장시료로부터 FT LTQ 질량분석기를 통해 얻어진 탄뎀 질량 스펙트럼에서 전구이온 분자량의 분포를 역순서열을 이용하여 분석하였다. 전구이온 분자량의 분포를 재해석하여 실험값의 정확도를 보정하고 단백질 동정의 성능을 향상시키는 방법을 모색하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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