파밤나방 유충을 이용한 효율적인 SeNPV의 생산을 위하여, 파밤나방유충의 령기와 접종농도에 따른 병원성과 관련하여 바이러스 생체 증식 효율을 조사하였다. 그 결과, 파밤나방 유충을 이용한 SeNPV의 대량생산은 4령 유충에 1.0$\times${TEX}$10^{6}${/TEX} 다각체/ml 농도로 접종하였을 시 약 86.7%의 사충율과 함께 최대 바이러스 생산성을 보여 가장 효율적임을 알 수 있었다.
야생주 핵다각체병 바이러스의 낮은 병원성에 대해 살충제로서의 파밤나방 핵다각체병 바이러스(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus: SeNPV)의 병원성 향상을 꾀함과 동시에 재조합 바이러스가 다각체 내에 매립됨으로써 살충제로의 적용시 야외에서의 안정성을 확보할 수 있는 p10 유전자의 프로모터를 이용한 새로운 발현벡터를 개발하기 위하여 국내분리주 SeNPV의 p10 유전자 구조를 분석하였다. 그 결과, SeNPV p10 유전자의 프로모터와 구조유전자 부위를 포함한 545염기서열을 결정하여 기존에 보고된 SeNPV p10 유전자(Zuidema et al., 1993)와 비교한 결과 구조유전자 부위에서는 100%의 상동성을 보였으나 5` 및 3` flanking region의 4개의 염기서열에서 차이를 보였다. Southern hybridization에 의하여 SeNPV전체 genomic DNA상에서 p10 유전자는 Sph I 2.4Kb와 Cla I 4.0Kb 단편내에 각각 존재함을 확인하였으며, p10 유전자를 포함하는 이들 단편을 각각 클로닝하여 제한효소 지도를 작성한다.
국내에서 분리된 파밤나방 핵다각체병바이러스(Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus: SeNPV)의 생화학적인 특성을 규명하기 위하여 몇가지 실험을 행하였다. SeNPV는 하나의 envelopeso내에 다수의 nucleocapsid가 존재하는 MNPV(multiple embeded NPV)형태였다. 다각체단백질은 분자량 30kb의 단일 band로 나타났으며, Spodoptera litura NPV와 Bombyx mori NPV의 다각체단백질 항체에 반응하여 뚜렷한 침강선을 형성하였다. 비리온 단백질을 은염색한 결과, 많은 수의 minor band들이 포함된 49개의 band로 나타났으며, 바이러스 DNA를 분리하여 여러종의 제한효소에 의한 대략적인 genome size는 약 110kb 였다.
곤충 바이러스인 Baculoviridae의 subgroup A에 속하는 핵다각체병 바이러스는 미생물 살충제로서, 또는 유용물질의 생산을 위한 발현벡터로서 현재 널리 연구·이용되고 있다. 본 연구에서는 이러한 NPV중 국내에서 분리된 SeNPV의 다각체 단백질 유전자의 구조적 특성을 구명함으로써 새로운 발현벡터를 제작하고자 하였다. 이를 위해 SeNPV의 다각체 모양을 전자현미경으로 관찰하고, 다각체 단백질의 분자량과 그 유전자의 구조를 각각 SDS-PAGE 및 염기서열 결정법에 의해 결정하였다. 그 결과, SeNPV의 다각체는 분자량 30 kDa의 단일 단백질로 이루어진 부정형의 구조였으며, 다각체 단백질 유전자의 염기서열을 포함한 876 염기의 서열을 결정하였다. 또한, SeNPV 전체 DNA상에서 다각체 단백질 유전자는 Xho I 3.0 Kb와 Nco I 6.0 Kb에 각각 존재함을 확인하고, 각각 cloning하여 제한효소 지도를 작성하였다.
AcNPV에 대해 감수성을 보이는 파밤나방 세포주인 Se301 세포주의 AcNPV를 이용한 발현 벡터계에서의 유용성을 알아보기 위하여 Se301세포주에서 AcNPV의 감염 특성을 Sf-21 세포주에서와 비교하였다. 그 결과, 바이러스의 감염상은 두 세포주에서 거의 유사하였으나 감염 7일 후에 세포로부터 방출된 다각체의 비율은 Se301 세포주에서 훨씬 높았다. 또한 전체 다각체 생성율은 Se301 세포주에서 약간 높았지만 그 차이는 매우 근소하여 대체적으로 두 세포주에서 거의 비슷하였으나 생성된 다각체의 크기는 Se301세포주에서 더욱 컸다. 한편, 세포주나 바이러스의 증식율과는 무관하게 AcNPV에 의한 다각체 단백질의 발현량이 Se301 세포주에서 약 2.4배 높게 나타남으로써 Se301 세포주가 AcNPV를 이용한 발현 벡터계에서 숙주 세포로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 보여 주었다.
광식성 난방제 해충인 파밤나방(Spodoptera exigua)의 친환경적 방제원으로써 이용을 위해 국내에서 분리된 파밤나방 핵다각체병바이러스(S. exigua nucleopolyhedrovirus K1: SeNPV-K1)의 형태 및 전체 유전체 서열을 분석하였다. SeNPV-K1의 다각체(polyhedra)는 0.6-1.8 um 크기의 부정형으로, 기 보고된 SeNPV와 외형적 차이는 보이지 않았다. 전체 유전체의 염기서열을 분석한 결과, 기 보고된 SeNPV와 비교할 때 145 bp 더 많은 135,756 bp로 확인되었으며, G+C 함량은 44% 였고 상동반복영역은 6개로 두 바이러스간에 차이는 없었다. ORF 분석결과, SeNPV-K1은 기 보고된 것과 비교할 때 2개 더 적은 137개를 가지며, SeNPV-K1에만 존재하는 ORF는 4개가 확인되었다. 이들 4개의 ORF는 비필수 유전자로 바이러스의 특성에는 큰 영향을 주지 않을 것으로 여겨졌다. 유전체의 vista 분석 결과, SeNPV-K1과 기 보고된 SeNPV의 전체 염기서열 유사도가 매우 높은 것으로 확인되었다. 국내에서 처음으로 분석한 SeNPV-K1의 전체 유전체는 기 보고된 SeNPV와 유사한 것으로 나타났으나 서로 다른 분리주로 국내 고유자원임을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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