다운증후군 환자의 치아우식증과 구강내 여러 요인들과의 연관성을 평가하고자 9-18세의 다운증후군 환자 25명과 정상인 63명을 대상으로 치아우식경험지수, 치태지수를 조사하고 효소면역분석법을 이용하여 타액의 면역항체 IgA와 뮤탄스 연쇄상구균-특이 IgA농도를 측정하고, Dentocult 키트를 이용하여 뮤탄스 연쇄상구균과 유산간균의 수, 타액의 완충능을 측정하여 두 군의 각 값들을 독립 t-test와 카이제곱 검정을 시행하였다. 다운증후군 환자에서 유치우식경험은 정상인에 비해 유의하게 낮았으나(p<0.001), 영구치우식경험은 유의한 차이를 보이지 않았다. 치태지수와 타액의 IgA의 농도는 두 군간에 차이를 보이지 않았으며, 뮤탄스 연쇄상구균 특이-IgA 농도와 타액 완충능은 다운증후군환자에서 낮았다(p<0.05). 뮤탄스 연쇄상구균 수와 유산간균 수는 두 군간에 유의한 차이는 없었다. 9-11세 군에서 뮤탄스 연쇄상구균의 수는 다운증후군 환자에서 정상인보다 낮았으며(p<0.001), 뮤탄스 연쇄상구균 특이-IgA는 다운증후군 환자에서 유의하게 낮았다(p<0.05). 유치의 치아우식경험치면지수는 완충능, 뮤탄스 연쇄상구균의 수와 유의한 상관관계를 보였다.
본 연구의 목적은 Streptococcus mutans의 Ag I/II와 glucosyltransferase에 대해 개발된 단일클론항체를 사용한 타액 내 Streptococcus mutans 검출의 효용성을 평가하기 위함이다. 세 군(성인, 미성년자, 그리고 교정치료중인 미성년자)을 대상으로 DMFT, $Dentocult^{(R)}$-SM strip mutans를 이용한 타액내의 colony density (CFU/mL), polymerase chain reaction을 이용한 Sreptococcus mutans와 Sreptococcus sobrinus의 존재여부, 그리고 4가지 단일클론항체를 사용한 타액 내 Streptococcus mutans 검출 실험을 시행하였다. 그 결과 Streptococcus mutans가 Streptococcus sobrinus보다 치아우식 형성에 더 주요하게 작용한다는 것을 입증하였으며, glucosyltransferases (gtf B, gtf C, gtf D)와 Ag I/II에 대한 단일클론항체들의 Streptococcus mutans를 검출해 내는 능력이 $Dentocult^{(R)}$-SM strip mutans나 polymerase chain reaction을 사용한 검출법보다 뛰어남을 보였다.
남성 및 여성의 타액내 testosterone의 농도를 측정하기 위하여 초감도 효소면역측정법 (ultrasensitive enzymeim-munoassay; EIA)을 정립하고, 이 EIA를 이용하여 한국인 정상 여성 및 남성의 타액에서 testosterone의 정상농도를 얻고자 하였다. 정상 월경주기를 가진 여성 18명에서 아침 6~9시 사이에 타액을 채취하였고, 남성의 타액도 오전 (9~10시)중에 채취하였다. EIA의 표지물질로는 horseradish peroxidase를 사용하였고, 기질은 ABTS [2,2'-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline sulphonic acid)]를 사용하였다. 항원 항체 결합형과 비결합형의 분리를 용이하게 하기 위해 항혈청을 microcrystalline cellulose 에 mixed anhydrohydride 방법을 이용하여 부착시켜 사용하였다. 항원항체 결합 후 기질을 첨가하여 반응을 시키고 발색시켜 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 본 EIA의 특성을 방사면역측정법 (RIA)과 비교하여 평가하였다. 본 실험에서 정립된 EIA의 감도 (sensitivity)는 약 25 pg/tube 이하이었고, 표준시료를 첨가해 측정치와 기대치를 비교한 정확도(accuracy)는 측정치 (Y) = 0.96 X 기대치 (X) - 0.89이었고 상관계수 (r)는 0.985이었다. 본 실험에서 생산하여 사용한 항체의 역가는 1/56,000이었고, 항체의 교차반응(cross-reaction)을 다른 8종의 steroid를 이용하여 조사한 결과 5 $\alpha$-dihydrotestosterone (DHT)와 52%로 나타났으나 다른 steroids와는 0.1% 이내의 교차반응도를 나타내었다. 정밀도 (precision)는 intra-assay variation 과 inter-assay variation의 변이계수 (coeffcient of variation)가 10% 내외로 만족할 만한 범위에 들었다. 본 실험 방법을 타액과 혈청내 testosterone 농도 측정에 응용하여 RIA의 결과와 비교하여 본 바 상관관계가 타액에서 r=0.969, 혈청에서 r=0.990으로 두 결과가 잘 일치하였다. 본 실험에서 측정된 한국인 여성의 타액내 testosterone농도는 107.7$\pm$12.0 pmol/l이었고, 남성의 타액내 농도는 274.2$\pm$22.1 pmol/l이었다. 이상의 결과로 보아 본 연구에서 정립된 EIA 방법은 RIA를 대신하여 소규모의 실험실에서도 활용할 수 있을 것으로 사려된다.
Streptococcus mutans는 구강 내에 상존하는 치아우식증의 주요 원인균으로서 치면의 피막에 부착 후 glucan을 형성하여 세균의 군락을 이루며, 외부로부터 공급된 자당대사를 통하여 유기산을 생성함으로써 법랑질을 탈회시킨다. 치아우식 활성도의 평가를 위한 단클론항체를 이용한 방법은 진료실에서 빠른 시간 내에 간편하게 타액에 존재하는 Streptococcus mutans의 정량분석이 가능한 방법이다. 이 연구는 3세에서 6세 사이의 어린이 15명을 대상으로 자극성 타액을 채취하여 시판 중인 단클론항체를 이용한 Salivacheck$^{TM}$ Mutans, strip을 이용한 Dentocult$^{(R)}$-SM 그리고 MSB배지 배양법으로서 타액 내 Streptococcus mutans를 측정한 후 그 값을 우식경험치아수와 비교하여 상관관계를 알아보았다. Saliva-check$^{TM}$ Mutans를 이용한 방법은 Dentocult$^{(R)}$-SM과 MSB배지법과 통계학적으로 유의한 상관관계를 보였으나(p<0.05), MSB배지법은 어린이의 우식경험치아수와 통계학적으로 유의한 결과를 나타내지 않았다(p=0.34).
본 연구는 정상인과 정신지체인의 치아우식증과 이와 관련된 다양한 요소들을 비교 평가하고자 정상인 63명과 정신지체장애인 31명을 대상으로 우식경험지수, 치태지수를 조사하고, Dentocult 키트를 이용하여 뮤탄스 연쇄상구균과 유산간균의 분포정도와 타액의 완충능을 측정하고, ELISA(효소면역분석법)를 이용하여 타액의 면역항체 IgA와 뮤탄스 연쇄상구균-특이 IgA 농도를 측정하였다. 우식경험 영구치면지수와 치태지수는 정신지체인에서 정상인에 비해 유의하게 높았다. 타액 항체 IgA 농도는 두 군간에 차이를 나타내지 않았으나 뮤탄스 연쇄상구균 특이-IgA 농도는 정상인에서 유의하게 높았다. 완충능은 정신지체인에서 정상인에 비해 더 낮았으며, 뮤탄스 연쇄상구균 수와 유산간균 수는 두 군간에 유의한 차이는 없었다. 연령별 비교시 우식경험 영구치면지수와 치태지수는 15-18세군에서 정신지체인이 정상인에 비해 높았다. 뮤탄스 연쇄상구균 수와 유산간균 수는 9-11세군에서는 정신지체인보다 정상인에서 더 높았으나 12-14세군부터는 정신지체인에서 더 높은 양상을 보였다. 15-18세군에서 치아우식경험치면수는 완충능과 역상관관계를 보이고, 치태지수, 뮤탄스 연쇄상구균, 유산간균과 상당한 상관성을 보였다. 이상의 연구결과를 통해 정신지체인은 나이가 증가할수록 정상인보다 우식경험치면수가 많았고, 치태가 많았으며, 뮤탄스 연쇄상구균과 유산간균의 수가 많고, 타액의 완충능과 뮤탄스 연쇄상구균 특이-IgA 농도가 낮음을 알 수 있었다.
본 연구는 어린이의 치아우식증을 야기하는 주된 원인균인 Streptococcus mutans에 대한 타액내 Immunoglobulin A의 양을 좀 더 쉽고 빠르며 정확하게 분석하는 방법을 개발하는데 일차적 목적을 두었고 이 방법을 사용하여 우식 경험군과 비경험군 간의 타액내 IgA 역가에 차이가 있는지 관찰하였다. 본 연구에서 사용한 immune-slot blot method에서 항체 역가 측정의 기본 개념은 Streptococcus mutans의 단백질을 1/2씩 희석하여 nitrocellulose membrane에 결합시킨 후 1/100으로 희석된 타액에 의해 검출될 수 없는 최대의 단백질 희석배수를 구하는 것이다. 연구 결과 우식 경험군과 비경험군의 희석배수 평균치는 우식 비경험군이 $2^{6.278{\pm}2.260}$, 우식 경험군이 $2^{5.730{\pm}0.499}$로 IgA의 농도가 우식 비경험군에서 약간 높게 나타났다. 그러나 우식 비경험군의 경우 표준편차가 매우 높아 양 군간에 유의한 차이는 없었다.
점액질이 풍부한 꼼치 조직에서 NIH 3T3 세포주를 이용하여 subtracted cDNA 라이브러리를 얻어 200례의 클론을 제작하였다. 이 클른 중에서 비반복성 유전자를 선택하고, RNA in situ hybridization을 실행하여 꼼치 조직에서 특이하게 발현되는 곰신 클론(C90-171)을 선택하였다. 이 클론은 사람의 타액선 조직에서도 특이하게 발현되는 유전자로서 이를 확인하기 위하여 C90-171(곰신) 항체를 제작하였다. 꼼치의 cDNA 라이브러리에서 곰신의 항체를 통하여 스크리닝한 결과 PRP(proline-rich protein)와 가장 많이 교차반응하며, 면역조직화학적 염색으로 PRP와 유사한 양성반응으로 나타나 PRP와 유사한 기능을 하는 단백질로 사료된다. 또한 타액 내에서의 꼼치 단백질의 분해에 대한 실험결과 거의 분해가 일어나지 않는 것으로 보아, 곰신은 꼼치의 몸통을 보호하는 유전물질일 뿐만 아니라, PRP와 유사하게 조직을 보호하는 안정된 새로운 기능성 단백질로 사료된다.
본 연구는 임상에서 사용되는 진단도구들이 소아에서 우식위험도와 상관관계를 가지는지 여부를 확인하고, 소아에서 우식위험도를 효과적으로 반영하는 지표가 무엇인지 알아보기 위함이다. 32명의 6세 미만의 소아를 두 군(I군 : dmft < 6, II군 : dmft > 6)으로 나누었다. Plaque-check PH을 이용해 치태의 pH를 측정하고, Saliva-check buffer를 이용해 타액의 pH와 완충능력를 측정하였다. S. mutans 검출을 위해 Saliva-check mutans와 Cytoperio analysis system을 이용하였다. 타액 완충능력은 두 군에서 유의한 차이를 보이며 dmft와 상관관계를 보였고, 타액의 pH와도 유의한 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 두 군 사이에 치태 pH, 타액 pH의 유의한 차이는 관찰되지 않으며 dmft와 상관관계를 가지지 않는 것으로 밝혀졌다. S. mutans의 단일클론항체를 이용하는 Saliva-check mutans와 real-time PCR에 기반한 Cytoperio analysis system은 dmft와 유의한 상관관계를 가지고 있지 않는 것으로 밝혀졌다.
스트레스가 타액선 조직을 변형시키고 파괴시킬 수 있다는 것은 이미 보고된 바 있다. 이는 구속스트레스 시에 관찰되는 apoptosis에 의한 것인데, 이 과정에 관여하는 caspase-3는 세포의 DNA를 분절시킴으로서 apoptosis를 일으킨다고 알려진 세포내 단백효소이다. 이에 기존에 관찰되었던 구속 스트레스에 의한 apoptosis의 형태적 변화가 apoptosis를 유도하는 caspase-3와 어떠한 시기적 상관관계를 가지고 있는지를 구명하기 위하여 본 실험을 시행하였다. 웅성 백서 (Sprague-Dawley, 8주) 를 사용하여 실험 전 기간에 걸쳐 구속스트레스를 가한 후 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 3일, 5일, 7일에 희생시켰다. 그 후 실험동물의 악하선을 절취하여 동결절편을 제작한 후, caspase-3에 대한 형광항체로 면역형광법을 시행하여 관찰하였다. 1. 정상대조군에서는 caspase-3가 타액선 조직 전반에서 미약하게 관찰되었다. 2. 구속스트레스 부여 30분에서 caspase-3는 강반응을 보였고, 실험기간이 경과됨에따라 점차 6시간군에서 부터는 현저히 감소하였다. 3. Caspase-3는 구속 스트레스 30분에 도관과 선포세포 모두에서 발현되었으나, 선포세포에서는 조기에 급격히 소실되었고 도관세포에서는 전 실험 기간에 걸쳐 서서히 소실되었다. 이와 같은 연구 결과에서, 세포내 caspase-3는 조직의 형태적 변화가 나타나기 이전에 발현하는 것으로 보아 caspase-3는 형태적 변화를 예견할 수 있는 진단 지표로 사용될 수 있을 것으로 사료되며 이후 임상적으로 적용하기 위한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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