• 제목/요약/키워드: 체외 성숙

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난자의 회수시기, BSA, Cysteine 및 Myoinositol이 개 난자의 체외성숙에 미치는 영향 (Effects of Ovarian Estrus Stage of Oocytes and Supplementation of Medium with BSA, Cysteine and Myoinositol on in vitro Maturation of Canine Oocytes)

  • 김상근;이봉구;이규승
    • 농업과학연구
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    • 제34권1호
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    • pp.13-18
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    • 2007
  • 본 연구는 난자의 채취시기, 배양액에 BSA, cysteine, myoinositol 첨가가 난자의의 체외성숙에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 휴지기, 난포기, 황체기로 구분한 난소로부터 채취한 난포란을 배양하였을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $10.0{\pm}4.1%$$5.7{\pm}1.6%$로서 난포기에 채취한 난자가 휴지기와 황체기의 난자에 비해 체외성숙율이 높게 나타났다. 2. 휴지기, 난포기, 황체기 난포로부터 회수한 난자를 5% BSA와 0.1 mM cysteine를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $15.8{\pm}4.7%$$5.6{\pm}1.5%$로서 난포기의 난자가 가장 높은 체외성숙율을 나타냈다. 3. 휴지기, 난포기, 황체기 난포로부터 회수한 난자를 5% BSA와 10mM myoinositol를 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $0.0{\pm}0.0%$, $18.4{\pm}4.6%$$5.7{\pm}1.9%$로서 난포기 난자의 체외성숙율이 가장 높게 나타냈다.

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체외배양을 위한 돼지 난소 및 난포란의 형태학적 조건 (Morphological and Cellular Criteria of Ovaries, Follicles and Oocytes for In Vitro Maturation in the Pig)

  • 변태호;이상호
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제7권2호
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    • pp.97-110
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    • 1992
  • 돼지난포란의 안정된 체외배양 체계를 위하여 도살장에서 재취된 난소로부터 난포 및 난자난구세포체의 혀태적인 선정기준을 설정하고 이의 이론적 배경을 확립하였다. 난소를 난포상태 및 분포나 황체 존재 여부에 따라 A,B 및 C 의 세 가지 형태로 분류하고 각 type의 난소에서 직경 3-5mm인 난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수된 난포란을 난구세포 부착상태에 따라 Good, Fair 및 Poor 의 세 가지 형태로 분류하여 각각을 호르몬이 첨가된 M16+FCS 배양액으로 35시간 동안 체외배양하여 성숙율을 비교 검토 하였다. 난소의 형태에 따라 회수된 난포란 중 Good 또는 Fair 형태는 Type A 및 C 난소에서 85%를 차지한 반면, Type B 난소에서는 53%에 불과하였다. 또한 이들 난포란을 체외배양한 결과 Type A 및 C 에서 회수된 난포란은 90 및 85%의 높은 성숙율을 보인 반면, Type C 의 난포란은 33%의 저조한 성숙을 나타냈다. 한편 핵형 분석 및 조직학적 분석에서도 Type C 난소의 경우 난포란의 핵형이 대부분 GVBD 및 퇴화 형태를 보였으며, 폐쇄포난포의 비율도 Type A 난소의 53%에 비해 월등히 높은 85%를 나타내어 성숙율 비교실험의 결과와 일치되는 경향을 나타내었다. 따라서 본 실험의 선별기준에 의한 돼지 난소 및 난포란의 형태적 분류 작업에 의해 난포란의 체외배양 성적 향상 및 안정된 배양체계의 확립이 가능하였다.

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소 초기배의 체외수정에 관한 연구 (Studies on the In vitro Culture of Early Bovine Embryos)

  • 황우석;권오경;조충호
    • 한국임상수의학회지
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    • 제7권2호
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    • pp.517-519
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    • 1990
  • 소 난소로부터 난자를 채취하여 체외성숙과 체외수정을 실시하였다. 난의 성숙배양을 위한 배양액은 소 태아혈청을 첨가한 TCM 199으로 $CO_2$배양기에서 24시간 배양하였다. 체외수정에는 동결융해정액을 사용하였으며 Caffeine과 Ca Ionophore 처리후 매정에 공하였다. 배양난자중 40%가 Metaphase II까지 성숙하였다. 성숙율에 대한 소 태아혈청의 농도변화와 HEPES 첨가여부의 효과는 없었다. 체외수정율과 분할율의 성적은 각각 23.1%와 14.4%였다.

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돼지 난모세포의 성숙과정에서 Phosphatidylinositol 대사의 기질 및 억제인자의 영향 (Influence of the Substrate and Inhibitors Related to Phosphatidylinositol Metabolism in the Maturation Processes of Porcine Oocytes)

  • 강승률;양보석;조인철;이성수;정진관
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제16권2호
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    • pp.91-98
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    • 2001
  • 본 연구는 phosphatidylinositol 대사의 기질 및 억제물질이 돼지 난모세포의 체외 성숙·수정에 미치는 영향에 대하여 실험을 하였다. 난모세를 inositol (250 mM) 첨가 또는 무첨가한 mTLP-PVA 배양액에서 46시간 체외배양하였다. 성숙이 완료된 난모세포는 신선 돼지정액을 이용하여 6시간 동안 mTALP-PVA 배양액에서 체외수정을 시켰다. 수정 후 6시간에 이들 난모세포를 10% 혈청을 첨가한 TCM-199 배양액에서 추가로 12시간 배양하였다. 제 2성숙분열중기로 성숙한 남모세포의 비율은 대조구 (67.3%)에 비하여 inositol (81.4%)을 첨가하여 46시간 체외성숙시킨 난모세포에서 더 높았다 (P<0.05). 체외수정 후 18시간에 웅성전핵 형성율은 대조구의 27.3%보다 inositol (42.0%)을 첨가한 배지에서 성숙시킨 난모세포에서 더 높게 나타났다 (P<0.05). 난모세포의 성숙에 대한 inositol의 작용을 조사하기 위하여 LiCl (10 mM) 또는 dbcAMP (0.5 mM)를 첨가한 배지에서 난모세포를 배양하였을 때, 이들 두 약제는 난모세포의 성숙을 억제하였다 (P<0.05). 그러나 이 두 약제의 억제작용은 inositol 첨가에 의해 해제되어 대조구 수준까지 성숙율이 개선되었다. DbcAMP와 verapamil은 상승작용을 하여 난모세포의 성숙을 억제하였다. Verapamil을 단독으로 첨가하였을 때, 난모세포의 성숙분열 개시에는 영향이 없었으나 제 2성숙분열중기로의 성숙은 억제되었다. 이상의 결과로부터, inositol 첨가에 의해 PI-Cycle이 활성화되어 간모세포의 핵 및 세포질 성숙과 막의 변화가 유도되어 난모세포의 성숙이 inositol 첨가에 의해 개선되었다는 것이 시사되었다.

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Polyvinylpyrrolidone 첨가가 돼지 체외 수정란의 발달과 세포수에 미치는 영향 (Effect of the Addition of Polyvinylpyrrolidone on In Vitro Development and Cell Number of Porcine Embryo after In Vitro Fertilizatin)

  • 박용수;김재영;박흠대
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제21권2호
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    • pp.121-128
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    • 2006
  • 본 연구는 고품질의 돼지 체외 수정란을 생산하기 위하여 체외 성숙 배지에 첨가하는 polyvinylpyrrolidone(PVP)의 분자량, 첨가 농도 및 시간(실험 1)과 체외 성숙 수정 배양 단계에서 PVP의 첨가(실험 2)가 배 발생과 세포수에 미치는 효과를 검토하였다. 돼지 미성숙 난자의 체외 성숙은 NCSU 23 용액, 체외 수정은 mTBM 용액, 체외 배양은 PZM 3 용액을 이용하였다. 체외 성숙용 배지에서 PVP의 분자량, 농도 및 첨가 시간에 따른 수정율과 배반포 발달율은 차이가 없었다. 그러나 배반포의 부화율은 분자량 40,000(30.1%), 0.5%(28.6%) 및 $0{\sim}44$시간(37.5%) 첨가군이 다른 시험군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05). 분자량 40,000 0.5% PVP를 체외성숙, 수정 및 배양 배지에 각각 첨가(W) 또는 미첨가(W/O)한 결과, 수정율은 체외성숙 수정 배양에서 W-W/O-W 군이 69.3%, 배반포 발달율과 부화율은 W-W/O-W 및 W-W/O-W/O 군이 각각 12.6과 30.0% 및 14.0과 37.5%로서 다른 군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05). 총 세포 수와 Trophoblast 수는 처리군 간에 유사한 경향이었으나, Inner cell mass 수는 W/O-W/O-W 군이 평균 7.4개로서 가장 높았다 (p<0.05).

한우 난구 복합체의 체외발생에 있어서 FGF(Fibroblast Growth Factor)가 미치는 영향 (Effects of FGF on Embryonic Development In Vitro in Hanwoo COCs)

  • 최선호;조상래;김현종;최창용;한만희;손동수;정연길
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제21권2호
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    • pp.157-162
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    • 2006
  • 소 난포란의 체외 성숙은 과립막 세포, 난자의 핵성숙을 촉진하는 미지의 혈청내의 물질뿐만 아니라, 호르몬이나 생리 활성 인자 등에 의해 촉진됨이 밝혀졌다. 이에 따라 체외 성숙 및 체외 발달에 사용되는 배양액의 조성도 복합 배양액에서 단순 배양액으로 전환을 시도하고 있으며, 체내의 조건에 보다 더 접근하고자 하는 시도들이 수행되고 있다. 본 연구는 한우 난포란의 성숙 시 FGF의 첨가가 체외 성숙율 및 체외 수정 후 배발달율에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 한우 난포란의 체외 성숙시 FGF를 0.1, 1, 10 ng/ml를 첨가하였을 때 24 시간째에 Metaphase II 도달율은 각각 72.7, 70.0, 75.0%로서 무첨가 대조군의 37.5% 에 유의적으로 높은 성숙율을 보였다(p<0.05). 그러나 FGF 첨가 농도간에는 차이가 인정되지 않았다. FGF로 체외 성숙된 난포란의 체외 수정 후 배발달율은 0, 0.1, 1, 10 ng/ml FGF 첨가군에서 각각 25.0, 9.5, 0, 2.9%를 보여, 무첨가 대조군에 비해 FGF 첨가군에서 낮았다(p<0.05). FGF로 체외 성숙된 난포란을 체외 수정 후 10% FBS-HPM 199, 0.8% BSA-HPM 199 및 0.1% PVA-HPM에 배양한 결과 12.4, 12.8, 8.5%의 배반포 발달율을 보였으며, 무혈청 배양액인 IVMD, IVD에 배양한 결과 38.4 및 34.8%의 배반포 발달율로 유의적인 차이를 나타냈다(p<0.05). 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외 성숙시 유용한 물질이나, 한우 난자의 체외 발달에는 단독의 효과를 기대할 수 없었으며, 다른 생리 활성 인자들 간의 상호 관계에 대하여 더 많은 연구가 요구된다.

과배란유도 주기에서 얻어진 체외성숙 난자의 수정능: 고식적 체외수정시술과 세포질내정자주입법의 비교 (A Prospective Comparison of Fertilizability of in vitro Matured Human Oocytes Obtained from Stimulated Cycle: Conventional Versus ICSI)

  • 지병철;안소정;문정희;황은주;서창석;김석현;문신용
    • Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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    • 제36권4호
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    • pp.249-254
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    • 2009
  • 목 적: 고식적 체외수정시술과 세포질내정자주입법을 사용하여 체외성숙 난자를 수정시키고 수정률과 배발달율을 비교하고자 하였다. 연구방법: 2007년 1월부터 2008년 8월까지 난소과자극과 체외수정시술을 받은 59명의 여성에서 135개의 배아소포 단계의 미성숙난자만을 얻어 75 mIU/mL rFSH, 0.5 IU/mL rhCG, 10 ng/mL rEGF가 포함된 체외성숙용 배양액에서 최대 48시간까지 배양하였다. 체외성숙된 난자는 고식적 체외수정방법 (n=41) 또는 세포질내정자주입법 (n=94)을 이용하여 수정시켰으며 이후 배발달율을 관찰하였다. 결 과: 고식적 체외수정군과 세포질내정자주입군에서 체외성숙률은 각각 51.2%와 59.6%였고, 수정률은 각각 71.4%와 80.4%로 두 군간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 배발달율도 두 군에서 비슷하게 관찰되었다. 결 론: 난소과자극을 통해 얻은 미성숙난자는 고식적 체외수정법을 사용하더라도 세포질내정자주입법과 동등한 수정률과 배발달율을 보임을 확인하였다.

Adenylate Cyclase (ACi) 첨가가 돼지 난포란 체외 발달율에 미치는 영향

  • 박진기;이연근;성환후;임기순;이창현;이향흔;장원경;이훈택;정길생
    • 한국동물번식학회:학술대회논문집
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    • 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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    • pp.32-32
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    • 2001
  • 본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙시 Adenylate cyclase(ACi) 첨가가 돼지 수정란의 배발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 수행하였다. 돼지 난포란은 0.1% PVA, 3.05 mM D-Glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ LH, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ FSH 그리고 10 ng/$m\ell$ EGF가 첨가된 TCM-199 배양액에서 ACi를 농도별로 첨가하여 42~44 시간 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다. 그리고 ACi가 배발달율에 미치는 효과를 알아보기 위하여 체외수정 medium에 0, 0.1, 1% 첨가한 다음, 체외수정을 유도하고 체외배양을 실시하였다 체외성숙시 22시간 동안 ACi를 0, 0.1, 1, 및 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 처리한 결과 33.3, 31.5, 34.1, 및 36.0%로 대조구와 처리구간의 통계학적인 유의한 차이는 나타나지 않았다. 그러나 체외성숙시 ACi을 0, 0.01, 0.1, 1.0 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 처리한 결과, 25.5%, 33.3, 26.7, 및 25.6%의 배발달율이 확인되어 유의한 ACi의 처리효과가 확인되었다. 이러한 처리효과는 ACi를 0.01%로 첨한 처리구(배발달율, 33.3%)에서 가장 높게 나타났다. 그리고 체외수정시 caffeine과 ACi를 첨가한 실험에서, 1 mM caffeine과 ACi를 0, 1, 10, 20 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 첨가한 결과, 대조구(30.4%)에 비해 처리구(40.9, 37.9, 및 43.5%)에서 높은 배발달율을 나타냈다. 0.5 mM caffeine과 ACi를 0, 1, 10, 20 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 로 첨가시는 대조구(37.8%)와 처리구(36.5, 36.0, 및 36.0%)간의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 ACi가 배발달율에 미치는 효과를 알아보기 위하여 체외수정 배양액에 0, 0.1, 1% 첨가한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같이, 처리구(30.3와 37.0%)가 대조구(22.6%)보다 통계학적으로 유의하게 높은 배발달율을 나타냈다. 따라서 본 연구의 결과는 체외성숙 또는 체외수정용 배양액 내에 ACi을 첨가함으로써 초기배의 발달을 효과적으로 유도할 수 있을 것이며, 앞으로 이러한 기술을 활용한다면 좀더 효율적으로 형질전환 동물이나 복제동물을 생산하게 될 것으로 사료된다.

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$\beta$-Mercaptoethanol이 돼지 체외수정란의 생산에 미치는 영향

  • 한만희;구덕본;이경광;박창식;서길웅;정영채;이규승
    • 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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    • 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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    • pp.81-81
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    • 2002
  • $\beta$-Mercaptoethanol($\beta$-ME)은 일반적으로 황화합물(thiol compounds)의 일종으로, 배양액 중에서 이황화결합(disulfide bonds)을 분해하여 일정한 물질의 산화.환원반응에 관여하며, 특히 cysteine이 cystine으로 산화되는 것을 차단함으로서 cysteine의 이용능력을 증대시키고, GSH의 합성을 촉진 및 증대시키는 것으로 알려져 있고, 각종 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. 특히, 돼지수정란의 체외배양체계에 유의적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Abebydeera 등, Theriogenol., 50:747-756, 1998). 따라서 본 실험에서는 돼지난포란의 체외성숙시 $\beta$-ME의 첨가배양이 체외수정과 배발달에 미치는 영향에 관하여 조사하였다. 돼지난포란을 10% PFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/m1 PMSG, 10IU/m1 hCG 및 10ng/m1 EGF가 첨가된 NCSU23 배양액에 $\beta$-ME를 각각 0, 25, 50 및 100uM을 처리하여 22시간 동안 배양을 실시하고, 성선자극호르몬이 배제된 배양액에서 추가로 22시간을 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙이 유기된 난자는 난구세포를 제거하고, 2.5mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 mTBM배양액에 정자를 1.25 $\times$ $10^{5}$cells/ml의 농도로 5-6시간 동안 공동배양을 실시하여 체외수정을 유도하였다. 체외수정후 일부의 수정란은 12시간에 난자 급속 염색방법으로 염색하여 다정자침입률 및 자.웅전핵형성률 등을 확인하였다. 그리고 나머지1-세포기의 수정란은 0.4mg/ml BSA가 함유된 NCSU23 배양액에 30 embryos/50ul 소적으로하여 38.8$^{\circ}C$, 5% $CO_2$의 탄산가스 배양기에서 각각 7일간 배양을 실시하였다. 조사된 결과는 SAS/STAT를 이용하여 통계분석을 실시하였다. 체외수정 12시간 후에 난자 급속 염색법으로 염색을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률(76.4~95.2%), 정자침투율(51.1~66.9%), 웅성전핵형성률(95.2~100%), 다정자침입률(18.2~25.6%) 및 평균침입정자수(1.2~l.4개)에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 체외배양 48시간 난할률을 조사한 결과, 처리구별 차이(53.9~67.9%)는 인정되지 않았으나, 배양 7일째 배반포형성률은 각각 14.5, 25.4, 17.3 및 12.4%로서 25uM의 $\beta$-ME처리구가 유의적(P<0.05)으로 높은 배발달률을 나타내었고, 총세포수에 있어서는 대조구와 처리구간 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 따라서 돼지 난포란을 성숙배양할 때, 25uM $\beta$-ME를 첨가배양하는 것이 양질의 돼지체외수정란을 생산하는 하나의 방법으로 조사되었다.다.

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돼지 체외성숙 난포란의 Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)에 의한 후기배로의 발달에 관한 연구 (Production of Embryos by Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) with In Vitro Matured Porcine Ooeytes)

  • 조성근;조황윤;박미령;이정규;김진회
    • 한국가축번식학회지
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    • 제25권2호
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    • pp.181-189
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    • 2001
  • 본 연구에서는 ICSI에 의한 돼지 체외수정란의 생산효율을 높이고자, ICSI에 사용되는 돼지 체외성숙 난포란의 원심분리에 의한 효과, 세포질내에 주입하는 정자의 DTT전처리 효과, 체외성숙 난포란의 체외수정시 주로 사용되는 IVF방법과 ICSI방법 사용에 따른 수정율과 후기배로의 배발달율 조사 그리고 IVF방법과 ICSI방법에 의해 발달한 배반포기배의 할구수를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. ICSI에 사용되는 돼지 체외성숙 난포란을 이용하여 원심분리를 실시하지 않은 군과 실시한 군에 있어서 수정율과 후기배로의 발달율에 있어서는 두 처리군간에 유의적인 차이는 나타나지 않았으며, 또한 ICSI에 사용되는 정자를 주입전에 DTT를 처리한 군과 DTT를 처리하지 않은 군에서의 수정율과 배반포기배로의 발달율에 있어서도 유의적인 차이는 나타나지 않았다 그리고 체외성숙 후 IVF 또는 ISCI에 의한 체외수정 후 수정율과 후기배로의 발달율에 있어서도 두 처리군간의 유의성은 나타나지 않았다. IVF와 ICSI에 의해 체외수정된 수정란에 있어서 8일째까지 발달한 배반포기배의 할구수를 조사한 결과 각각 46.7$\pm$2.9개와 41.9$\pm$4.6개로 나타나 두 처리군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, ICSI에 의한 체외수정란의 생산은 체외성숙후 난구세포가 제거된 난포란을 원심분리시키면 ICSI에 있어서의 편리를 도모할 수 있을 뿐만 아니라 주입된 정자의 관찰을 용이하게 하여 정확성을 높일 수 있고, 주입시 사용하는 배양액의 난포란내 진입을 최소화 할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 ICSI전 정자의 첨체반응 유도와 난포란의 활성화, 그리고 후기배로의 발달율 향상에 따른 할구수의 증가를 위한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 지금까지의 이러한 결과들을 바탕으로 하여 ICSI에 의한 체외수정란의 생산을 위한 연구가 지속적으로 수행해 나가야 할 것이며, 또한 계속적인 연구로 ICSI를 이용하여 외부유전자의 도입에 의한 형질전환동물의 생산이 가능 할 수 있을 것으로 사료된다.

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