• Journal of Embryo Transfer
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• v.19 no.3
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• pp.301-306
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• 2004

본 연구는 개의 신선 및 동결 정소상체 정액과 정소상체 정액을 saline가 tris-buffer액으로 희석하고 원심분리에 의해 정장성분을 제거한 정액의 성상과 및 동결보존 시의 생존성 및 난포란과 정소상체 정자의 체외수정 후 체외수정율과 분할율에 대해 조사하였다. 개 정소상체 정액을 saline으로 희석한 정액을 20분간 배양했을 때 정자농도는 3.50$\pm$0.80${\times}$l0$^{6}$ cells/$m\ell$, 정자의 활력은 72.45$\pm$4.55%, 기형정자 수는 7.40$\pm$1.20%로 나타났으며, 대조군인 사출정액의 정자농도는 5.45$\pm$0.50${\times}$$10^{6}$cells/$m\ell$, 정자의 활력은 92.55$\pm$4.65%, 기형정자 수는 3.25$\pm$0.45%와 비교할 때 정자농도와 활력은 낮았으며, 기형정자 수는 많았다. 개 정소상체 정액과 tris-buffer로 희석한 정액을 20분간 배양했을 때 정자농도는 3.80$\pm$0.36${\times}$$10^{6}$ cells/$m\ell$, 정자활력은 78.45$\pm$3.50%, 기형정자 수는 5.54$\pm$0.85%였으며, 희석하지 않은 정소상체 정액의 성상에 비해 약간 높게 나타났다. Tris-buffer로 희석한 개 정소상체 정액을 동결 융해했을 때 생존율은 57.50$\pm$4.20%, 활력은 52.70$\pm$5.50%였으며, 희석하지 않은 대조군의 생존을 74.50$\pm$6.25%와 활력 78.50$\pm$5.20%에 비해 현저히 높게 나타났다. 개 난포란과 신선 몇 동결 정소상체 정자와 체외수정시켰을 때 체외수정율은 각각 63.10$\pm$6.45%, 49.50$\pm$4.28% 및 42.84$\pm$5.90%, 22.30$\pm$5.60%로서 신선 정자에 비해 동결 정소상체 정자로 수정시킨 군의 분할율이 유의하게 낮았다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.17 no.2
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• pp.117-121
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• 2002

This study was carried out to investigate the in vitro fertilization rate of canine immature oocytes cryopreserved by vitrification freezing. The vitrification solutions of EPS and EDS were consisted of 40％ ethylene glycol 18％ Ficoll and 0.3M sucrose, and 20％ ethylene glycol, 16.5％ DMSO and 0.5M sucrose in TCM-199 medium supplemented with 10％ FCS, respectively. The oocytes were exposed The developmental rate of in vitro cultured oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle were 3.8％, 10.7％, 46％, respectively. to EFS or EDS at $25^{\circ}C$ and loaded into straw fer 30 sec. The straws was slowly immersed into L$N_2$. Fertilization and survival rate was defined as development rate on in vitro culture or FDA-test. 1. The fertilization rate after vitrification freezing of immature oocytes at 1, 6, 12 and 24 hrs after collection from ovaries was very low(5.3％～31.4％) than the unfrozen oocyte(60.0％). And the fertilization rate after vitrification freezing of immature oocytes was very higher than that of mature oocytes. 2. The survival rate after vitrification freezing of immature oocytes at 1, 6, 12 and 24 hrs after collection from ovaries was 55.0％, 40.0％, 28.6％ and 17.1％, respectively. And the survival rate after vitrification freezing of immature oocytes was slightly higher than that of mature oocytes.

• Proceedings of the Korea Water Resources Association Conference
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• 2021.06a
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• pp.92-92
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• 2021

체외수정을 기반으로 이루어지는 성게의 수정 과정은 성게 주변에서 형성되는 복잡한 난류 흐름의 영향을 받게 된다. 성게 몸체의 하류부에 형성되는 재순환 영역 (recirculation zone) 내에는 다양한 난류 와류 흐름이 존재하며, 이들은 성게 몸체에서 방출된 정자와 난자의 충돌을 일으키고 수정 과정에 지대한 영향을 미친다. 즉, 성게의 수정 과정을 이해하기 위해서는 성게 주변의 흐름에 대한 유체역학적 관점에서의 분석이 수행되어야 한다. 본 연구의 목적은 성게 몸체에 의해 발생한 난류 흐름이 성게의 체외 수정에 미치는 영향에 대해 조사하는 것이다. 이를 위해 본 연구에서는 상용 프로그램인 오픈폼 (OpenFaom)을 활용하여 수치 모의를 수행하였다. 성게 주변의 유동장은 LES (Large Eddy Simulation)을 기반으로 모의하였고, 정자와 난자의 확산 궤적은 라그랑지안 입자 추적 (Lagrangian Particle Tracking) 알고리즘을 통해 구현하였다. 총 5개의 유속 조건 (0.025 - 0.20 m/s) 에 대해 모의를 수행하였으며 정자와 난자 사이의 거리를 바탕으로 수정률을 산정하였다. 정자와 난자의 뭉쳐있거나 퍼져있는 공간적인 분포 형태는 Standardized Morisita 지수를 통해 수치적으로 표현하였으며 이들과 수정률과의 관계를 규명하였다. 연구 결과에 따르면 성게 수정은 유속 조건이 0.1 m/s일 때 가장 빈번하게 발생하였으며, 성게 수정의 성공 여부는 크게 2가지 조건에 의해 결정되었다. 첫 번째로, Standardized Morisita 지수가 높을수록 다시 말해 생식세포들이 공간적으로 뭉쳐있어야 하며 두 번째는, 생식세포들을 충돌시킬 수 있는 원동력인 작은 와류가 존재해야 한다. 와류의 크기가 너무 크게 되면 생식세포들은 충돌하지 않고 확산만 되기 때문에 오히려 수정률이 감소하였다. 영역별로 분석한 결과에 따르면, 성게 몸체에 의해 형성된 재순환 영역이 수정과정에 있어 가장 지배적인 영역임을 확인하였다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.26 no.2
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• pp.173-182
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• 2002

The mechanisms underlying of the visual assessment and resulting in optimum embryonic development following in vitro maturation, fertilization, and culture are unclear, It was known that in vitro produced embryos show more frequent occurrence of fragmentation, which resulted in poor developmental potential and decreased implantation rate. The objective of this study was to investigate the apoptotic rates in bovine blastocyst derived from in vitro fertilization (IVF) and nuclear transfer (NT). In addition, the expression levels of Bcl-2 and Bax gene were investigated in the blastocyst to confirm their potential roles in the regulation of apoptosis during preimplantation embryonic development. Analysis of apoptosis was carried out by using terminal deoxynucleotidyl transferase mediate dUTP nick end labeling (TUNEL) method. The levels of Bcl-2 and Bax gene in the blastocyst derived from IVF and NT were determined by RT-PCR. The proportion of TUNEL positive signal in blastocyst derived from NT was significantly higher than that in blastocyst derived from IVF (p<0.001). Bcl-2 expression level of blastocyst derived from IVF was higher than that of blstocyst derived from NT. However, high expression level of Bax was observed in the blastocyst derived from NT. These results indicates that apoptosis is more responsible for fiagmentation in bovine blastocyst derived from NT than IVF. These results suggested that the increase of developmental failure followed by NT could be caused by nuclear fragmentation as apoptosis.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.26 no.1
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• pp.1-7
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• 2002

The present study was carried out to investigate the effects of maturation media on penetrability of pig oocytes by liquid boar sperm coincubated with different sperm concentrations in a modified Tris­buffered medium (mTBM). Follicular oocytes collected from ovaries of prepubertal gilts were matured in a modified TCM-199 (mTCM-199) medium, modified Waymouth MB 752/1 (mWaymouth MB 752/1) medium or NCSU-23 medium. Oocytes (30~40) were transferred into each well of a Nunc 4-well multidish containing 0.5 $m\ell$ maturation medium. The sperm­ich portion of ejaculates with greater than 90% motile sperm were used in the experiment. The semen was cooled 22 to 24$^{\circ}C$ over 2 h period. The semen was diluted with Beltsville Thawing Solution (BTS) extender at room temperature to give 2$\times$10$^{8}$ sperm/$m\ell$ in 100 $m\ell$ plastic bottle. Liquid boar semen of 30 $m\ell$ in 100 $m\ell$ plastic bottle was kept at 17$^{\circ}C$ far 5 days. The sperm with greater than 70% motility after day 5 of storage were used for in-vitro fertilization (IVF). After 44 h maturation of immature oocytes in 5% $CO_2$in air at 38.5$^{\circ}C$, cumulus cells were removed and oocytes (30~40) were coincubated for 6 h in 0.5 $m\ell$ mTBM fertilization medium with five different (1$\times$10$^{6}$ , 2$\times$10$^{6}$ , 4$\times$10$^{6}$ , 6$\times$10$^{6}$, 10$\times$10$^{6}$ $m\ell$) sperm concentrations. At 6 h after IVF, oocytes were transferred into 0.5 $m\ell$ NCSU-23 culture medium fur further culture of 6 h. At 12 h after IVF, sperm penetration, polyspermy and male pronuclear formation of oocytes were evaluated. Oocytes of NCSU-23 maturation medium decreased polyspermy and increased male pronuclear formation compared to those of mTCM­199 and mWaymouth MB 752/1 maturation media. Of oocytes matured in NCSU-23 medium and inseminated in mTBM medium with 2~4$\times$10$^{6}$ $m\ell$ sperm concentrations, 50.8~50.9% showed sperm penetration, 13.3~19.5% polyspermy and 43.9~45.4% male pronuclear formation. In conclusion, we found out that oocytes matured in NCSU­23 medium and inseminated in mTBM medium showed superior in­vitro fertilization compared to those matured in mTCM­199 and mWaymouth MB 752/1 maturation media and inseminated in mTBM medium. The optimum sperm concentrations for in-vitro fertilization of oocytes matured in NCSU-23 medium by liquid boar semen stored at 17$^{\circ}C$ for 5 days were 2~4$\times$10$^{6}$ $m\ell$.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• v.23 no.1
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• pp.41-49
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• 1996

본 연구는 체외수정에 의해 생산된 생쥐 배반포기배를 vitrification 방법으로 동결보존하였을때 높은 생존율을 얻기 위한 적정조건을 검토하고자 실시하였다. 배반포기배를 생산하기 위하여, B6CBA F1 (C57BL/6, (표현불가)${\times}CBA/N$, (표현불가)) 계통의 생쥐 미수정란에 $1{\times}10^6$ spermatozoa/ml 농도의 정자로서 수정을 유도하였으며, 이후 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$배양기내에서 96시간동안 체외배양하였다. 배양 4일째의 배반포기배는 발달상태에 따라 early, middle 그리고 hatching blastocysts로 구분하였다. 본 실험에 사용된 동결보존액은 30% Ficoll과 0.5mol의 sucrose가 첨가된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol를 첨가한 EFS 40 (Zhu et al., 1993) 이었고, 수정란은 $25^{\circ}C$의 상온에서 먼저 20% ethylene glycol에 노출된 후 EFS 40 용액으로 옮겨 액체질소에 침지하는 2단계 동결법에 의해 동결보존되었으며, 급속융해하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 체외수정율과 배양 4일째 배반포기까지의 배발달율은 각각 89.4%와 86.1%였다. 2. 20% ethylene glycol에서 5분간 평형된 후 EFS 40 용액에 냉동보존된 후 융해된 난자의 생존율은 20% ethylene glycol에 0, 1, 3분간 평형된 난자의 생존율에 비해 유의하게 높았다. 3. 배반포기배를 20% ethylene glycol에서 5분간, EFS 40 용액에 1분간 차례로 노출한 다음 체와배양하였던 바, 배양 24시간째 생존율은 $82.9%{\sim}88.4%$ 였다. 본 연구 결과, 체외수정, 배양된 생쥐 배반포기배는 20% ethylene glycol과 EFS40에 대한 노출만으로는 난자의 생존성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것으로 미루어 보아 배반포기배의 초자화 동결이 가능함을 시사하였다. 따라서 동결 융해 후 높은 생존율은 상온에서 난자를 2단계 즉, 20% ethylene glycol에 5분간 평형시킨 후 EFS 40 용액에 노출하여 1분내에 LN2에 직접 침지하는 간편한 동결방법으로 얻을 수 있었다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.14 no.1
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• pp.84-91
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• 1990

Experiments were disigned to define and optimize efficiency of a system whereby pig follicular oocytes could be matured and fertil ized in vitro. The pig oocytes removed from 1- 2 mm and 3-7 mm follicles were cultured in vitro in the mKRB(-BSA) solution containing estrous sow serum (ESS), FCS or dialyzed pig follicular fluid for 24 to 48 hr at 37$^{\circ}C$. The oocytes matured in vitro were evaluated after epididymal spermatozoa-oocyte incubation for 24 hr for pronucleus formation. 50-60% of the oocytes reached metaphase II during 36 to 48 hr of culture. There was no differernce in oocyte matura¬tion between two groups of follicular size but meiosis was slightly faster in the 3-7 mm follicular oocytes. The oocytes matured in mKRB (-BSA) plus 5% ESS, 15% FCS or dialyzed follicular fraction showed slightly higher maturation rates than the control mKRB. in vitro fertilization, pronucleus formation, tended to be increased when mKRBi-BSA) plus 5% ESS or 15% FCS was used for oocyte maturation and in vivo -capacitated spermatozoa were inseminated, respectively. It is concluded that ESS, FCS and dialyzed pig follicular fluid may be effective factors for in vitro maturation and fertilization of pig follicular oocytes.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• v.29 no.3
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• pp.223-227
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• 2002

연구목적: 전반적인 자궁내막증이 체외수정시술에 미치는 영향을 알아보고, 특히 stage III-IV 자궁내막증을 갖는 불임환자 체외수정시술 결과에 대하여 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 연구재료 및 방법: 1998년 9월부터 2001년 9월까지 진단복강경을 통해 자궁내막증으로 진단된 환자 중 체외수정시술을 시행 받은 91명 131주기를 대상으로 하였으며 이중 stage III-IV의 자궁내막증을 갖는 환자는 27명 34주기였다. 비교군은 이시기에 진단된 순수 난관원인으로 체외수정시술을 시행한 40명 56주기를 대상으로 하였다. 통계학적 검사는 Student's t-test와 Chi-square test를 시행하였고, p<0.05를 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 결 과: 전체 자궁내막증 환자와 난관인자의 체외수정시술에서 두 군간의 나이는 $31.6{\pm}3.3$, $32.6{\pm}3.6$세로 비슷하였다. 채취된 난자의 수 ($10.3{\pm}6.6$ vs $11.7{\pm}5.1$), 성숙난자 수 ($7.4{\pm}4.7$ vs $7.7{\pm}4.9$), 수정율 ($70.2{\pm}32.4%$ vs $73.7{\pm}20.0%$), Good embryo quality rate (8세포 (G1+G2)를 2PN의 개수로 나눈 값) (32.6% vs 32.4%) 및 배아이식 수 ($4.6{\pm}1.4$ vs $4.8{\pm}1.1$)로 두 군간에 차이는 없었다. 또한 임상적 임신율의 경우도 각각 30.7%, 42.8%로 비슷하였다. 중등도 및 중증의 자궁내막증과 난관인자의 비교에서 성숙난자 및 채취된 난자의 개수는 각각 $8.8{\pm}4.9$, $7.7{\pm}3.9$, $11.3{\pm}7.0$, $11.7{\pm}5.1$개로 두 군간에 차이는 없었다. 수정율은 stage III와 IV 군에서 감소되는 경향을 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다 ($66.2{\pm}30.0%$ vs $73.7{\pm}20.0%$). Good qulity embryo rate (GQER)는 stage III-IV 자궁내막증 환자군에서 22.0%로 순수 난관인자의 32.4%에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다 (p=0.15, Chi-square test). 배아이식 수의 경우는 각각 $4.7{\pm}1.5$, $4.8{\pm}1.1$개로 차이가 없었다. 배아이식 주기당 임상적 임신율의 경우는 stage III-IV군에서 25.0% (8/32), 난관인자 군의 42.8% (24/56)로 통계학적인 유의성은 없었으나 (p=0.06, Chi-square test), 중등도 및 중증의 자궁내막증을 갖는 환자에서 임신율이 감소하는 경향을 보였다. 결 론: 체외수정시술시 자궁내막증이 임신율에 나쁜 영향을 미치지 않지만, 중등도 및 중증의 자궁 내막증을 갖는 불임환자의 체외수정시술에서는 임신율에 나쁜 영향을 끼칠 가능성이 있을 것으로 사료된다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.18 no.2
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• pp.135-142
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• 2003

본 연구는 사람의 시험관아기 프로그램에서 수정 후 1일째의 전핵 등급이 체외 수정란의 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 정상적인 시험관 아기 시술을 시행한 실례 환자를 대상으로 과배란을 유기하여 배란 직전의 난자를 채취하여 정자를 주입한 다음 체외 수정을 유도하였다. 수정 유도 18시간 후 전핵과 핵인의 형태에 따라 전핵의 등급을 1 및 2등급으로 나누어 각각 3일 동안 체외 배양을 실시하여, 체외 수정란의 형태에 따라 1, 2 및 3등급으로 분류하였든 바, 전핵의 등급에 따라 각각 1등급 체외수정란의 발달율은 1등급 전핵란에서는 83.5%로서 2등급 전핵란의 5.5%보다 유의적으로 (P<0.05) 높았다. 1등급 및 2등급 전핵란에서 수정 후 3일째에 5-세포기 이상의 단계로 발달하는 경우는 각각 85.1% 및 24.5%를 나타내었고, 평균 할구수는 7.4$\pm$2.1 및 4.1$\pm$3.5개를 나타내어 발달 능력에서 1등급 전핵란이 2등급 전핵란보다 유의적으로 (P<0.05) 높게 나타났다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.32-32
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• 2001

본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙시 Adenylate cyclase(ACi) 첨가가 돼지 수정란의 배발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 수행하였다. 돼지 난포란은 0.1% PVA, 3.05 mM D-Glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ LH, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ FSH 그리고 10 ng/$m\ell$ EGF가 첨가된 TCM-199 배양액에서 ACi를 농도별로 첨가하여 42~44 시간 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다. 그리고 ACi가 배발달율에 미치는 효과를 알아보기 위하여 체외수정 medium에 0, 0.1, 1% 첨가한 다음, 체외수정을 유도하고 체외배양을 실시하였다 체외성숙시 22시간 동안 ACi를 0, 0.1, 1, 및 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 처리한 결과 33.3, 31.5, 34.1, 및 36.0%로 대조구와 처리구간의 통계학적인 유의한 차이는 나타나지 않았다. 그러나 체외성숙시 ACi을 0, 0.01, 0.1, 1.0 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 처리한 결과, 25.5%, 33.3, 26.7, 및 25.6%의 배발달율이 확인되어 유의한 ACi의 처리효과가 확인되었다. 이러한 처리효과는 ACi를 0.01%로 첨한 처리구(배발달율, 33.3%)에서 가장 높게 나타났다. 그리고 체외수정시 caffeine과 ACi를 첨가한 실험에서, 1 mM caffeine과 ACi를 0, 1, 10, 20 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 첨가한 결과, 대조구(30.4%)에 비해 처리구(40.9, 37.9, 및 43.5%)에서 높은 배발달율을 나타냈다. 0.5 mM caffeine과 ACi를 0, 1, 10, 20 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 로 첨가시는 대조구(37.8%)와 처리구(36.5, 36.0, 및 36.0%)간의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 ACi가 배발달율에 미치는 효과를 알아보기 위하여 체외수정 배양액에 0, 0.1, 1% 첨가한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같이, 처리구(30.3와 37.0%)가 대조구(22.6%)보다 통계학적으로 유의하게 높은 배발달율을 나타냈다. 따라서 본 연구의 결과는 체외성숙 또는 체외수정용 배양액 내에 ACi을 첨가함으로써 초기배의 발달을 효과적으로 유도할 수 있을 것이며, 앞으로 이러한 기술을 활용한다면 좀더 효율적으로 형질전환 동물이나 복제동물을 생산하게 될 것으로 사료된다.