동결건조된 솔잎(Pinus densiflora needles)으로부터 냉수(PD-CW), 열수(PD-HW)와 메탄올추출물(PD-M)을 분획하여 in vitro에서 Peyer's patch를 경유한 장관면역 활성을 측정한 결과, PD-M 획분에서 유력한 골수세포 증식활성을 나타내었다. 메탄올 추출방법을 확립하기 위하여 MeOH 추출물을 균질화, 교반 또는 환류 등의 방법으로 조제하였을 때, 환류방법으로 조제된 MeOH 추출물에서 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 장관면역 활성을 in vitro에서 확인할 수 있었다. 솔잎으로부터 분획된 PD-M을 마우스에 경구 투여하고 Peyer's patch를 분리하여 ex vivo에서의 장관면역 활성도 관찰하였다. 다양한 농도로 1주일 동안 PD-M을 경구투여 한 결과, 1.0 g/kg of BW/day의 용량으로 경구투여 한 C3H/He 마우스의 Peyer's patch로부터 얻은 세포배양 상등액에서 saline 대조군보다 2.5배의 높은 장관면역 활성을 보여주었다(p<0.05). 또한 다양한 농도로 경구투여 된 Peyer's patch 세포의 배양액을 이용하여 측정한 IL-6 생산능은 1.0 g/kg of BW/day의 용량에서 1.13배로 증가하였으나 GM-CSF는 처리 용량에 따라 유의적인 값을 보이지는 않았다. 이러한 결과는 PD-M의 경구투여가 Peyer's patch 세포로부터 GM-CSF와 IL-6 등의 조혈세포 증식인자의 분비를 촉진함을 나타내는 것이며, 이러한 cytokine들이 골수세포 증식의 조절인자로서 작용함을 보여주는 것으로 생각한다.
90여종의 전통차 및 죽류용 식물로부터 조제된 다양한 용매추출물 중에서, 귤피(peels of C. unshiu)의 냉수추출물 (CUI-0)이 Peyer’s patch를 매개로 한 가장 높은 장관면역 활성을 나타내었으며 다시마(L. japonica), 둥글레(P. japonicum), 탱자(P. trifoliata)의 냉수추출물과 구기자(L. chinense) 및 치자(G. jasminoides)의 열수추출물을 제외한 나머지 식물의 용매추출물은 거의 활성을 가지지 못하였다. CUI-0는 MeOH-가용성 획분(CUI-1), MeOH-불가용성이면서 EtOH-가용성 획분(CUI-2)과 조다당 획분(CUI-3)으로 분획되었다. 이러한 획분들 중 CUI-3은 Peyer’s patch 세포를 매개로 하는 골수세포 증식의 자극활성이 가장 높았으며 arabinose, galacturonic acid, galactose, glucose, glucuronic acid와 rhmanose(molar ratio; 1.00:0.53:0.45:0.28:0.28:0.19) 등을 주요 구성당으로 함유하고 있었으며 소량의 단백질(9.4%)도 구성물질로 포함된 활성 획분임이 밝혀졌다. CUI-3의 장관면역 활성은 pronase 및 periodate 처리에 의해 감소되었으며 특히 periodate 산화는 CUI-3의 활성에 심각한 영향을 끼치는 것을 알 수 있었다. 활성 획분으로서 당 함량이 높은 CUI-3IIb-3-2는 DEAE-Sepharose FF, Sepharose CL-6B 및 Sephacryl S-200에 의해 귤피 냉수추출물의 조다당 획분으로부터 정제되었으며 HPLC에 의해 분자량 약 18,000 Da의 단일 peak임을 확인하였다. CUI-3IIb-3-2는 주로 arabinose, galactose, rhamnose, galacturonic acid와 glucuronic acid(molar ratio; 1.00:0.54:0.28:1.45:0.63) 등의 구성당으로 구성되어져 있었으며 소량의 단백질(3.2%)이 함유되어진 물질로 구성되어 있었다. 한편 CUI- 3IIb-3-2는 Peyer’s patch를 경유하였을 때만 골수세포 증식활성을 나타내었으며 활성물질 자체가 직접 골수세포 증식활성에 관여하지는 않는것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 귤피의 장관면역 활성은 측쇄에 arabinose와 galactose 등의 중성당이 결합된 polygalacturonan 구조를 갖는 펙틴계통의 다당류에 기인하고 있음을 보여주었다.
혈장 cathepsin B 활성도 측정이 갑상선암 및 결절성 증식증의 수술 전 진단에 도움이 되는지를 알아보고자 분화갑상선암 32례, 결절성 증식증 7례, 대조군 5례의 혈장 cathepsin B 발현양상을 대조군과 함께 관찰하였다. 수술시 제거된 여포선암의 암조직, 결절성 증식증 조직의 cathepsin B 발현을 정상 조직과 비교하였다. 혈장 Cathepsin B 활성도는 정상 대조군에서 $168.94{\pm}15.10$ (${\times}10^{-2}$, mU), 결절성 증식증에서 $255.45{\pm}95.68$ (${\times}10^{-2}$, mU), 악성종양에서 $284.87{\pm}79.32$ (${\times}10^{-2}$, mU)로써 악성종양군과 결절성 증식증군에서 cathepsin B 발현이 정상 대조군보다 비교적 높게 나타났다(p<0.05). 혈장 cathepsin B의 정량적 비교를 위한 immunoassay결과에서도 결절성 증식증군($17.64{\pm}7.49\;ng/ml$)과 악성종양군($15.50{\pm}7.86\;ng/ml$)에서 정상대조군($4.85{\pm}0.61\;ng/ml$)보다 높은 수치를 나타내었다(p<0.05). 결절성 증식증 및 악성종양군의 조직 내 cathepsin B mRNA발현이 정상 조직에서보다 높게 나타났다. 따라서 혈장 cathepsin B는 갑상선세포의 비정상적인 증식시에 증가됨을 알 수 있으며, 갑상선암 혹은 결절성 증식증을 스크리닝하는데 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
Protein tyrosine kinases는 표적단백질의 tyrosine 잔기를 인산화하는 효소로서 다양한 종류의 성장인자, peptide 호르몬, cytokine 수용체 하위의 세포 내 신호전달에 관여한다. Non-receptor tyrosine kinase의 일종인 c-Src는 세포막에서 발생한 ligand-receptor 상호작용 하위의 신호전달에서 중요한 역할을 하며 C-terminal Src kinase (Csk)는 Src kinase의 C-terminal tyrosine 잔기를 인산화시켜 Src kinase의 활성을 저해한다. 이러한 Src-Csk loop를 통한 세포 내 신호전달과정은 세포의 증식과 분화, 사멸 조절에 중요한 기능을 갖지만 정소의 발생과 분화 과정에서 Src-Csk loop의 발현 및 정자형성 과정에서의 기능은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 생쥐 정소에서 출생 후 성적 성숙과정에서 Csk의 발현과 Src kinase 활성의 변동을 조사하였다. Csk mRNA 발현은 생 후 2주령 이하의 미성숙 정소에서 다량으로 발현되었고 사춘기 정소 이후에는 오히려 감소하였다. Csk 단백질의 발현 양상은 mRNA 발현양상과 일치하였다. c-Src kinase 활성은 생 후 2주에 급격히 증가하고 이 후 4주령에서 감소하다가 성체 (8주령)에서 다시 증가하여 가장 높았다. 성체 조직의 Csk 단백질 현존량이 미성숙 개체보다 적은 반면 Src kinase 활성은 가장 높아 Csk 발현의 감소는 Src kinase 활성을 증가하는 것으로 사료된다. 면역조직화학방법으로 정소 조직 내 Csk의 발현양상을 조사한 결과 Leydig cell, Sertoli cell, germ cell 등 도처에서 발현되었으며 Sertoli cell 에서의 발현은 세정관 상피의 구성에 따른 차이가 확인되었다. 성체의 세정관 내에서는 감수분열 이후의 정세포(spermatid)를 감싸고 있는 Sertoli cell의 강소측에서 강한 Csk 활성이 검출되어 생식세포의 분화과정 동안 세정관 상피의 조직재구성에 관여하는 것으로 사료된다. Leydig cell에서의 발현은 생후 1주령까지는 미미하였으나 이후 2주령 이후에는 다량으로 발현함이 확인되어 adult type Leydig cell에서 진행되는 steroidogenesis와의 관련성을 추측할 수 있다. 미성숙 정소로부터 분리한 Sertoli cell-enriched culture에 200 nM testosterone을 처리하였을 때 Csk mRNA의 발현의 증가를 확인할 수 있었으므로 androgen에 의한 Sertoli cell의 분화과정에 Csk가 관여하고 있음을 알 수 있다. 결론적으로 성적 성숙에 따른 생쥐 정소 내 Src-Csk loop의 발현과 Src kinase 활성의 변동은 정소 내 간충조직, 세정관 상피의 증식 및 기능적 분화 과정을 매개하는 생리적 활성분자 수용체 하위의 신호전달 과정에 Src-Csk loop에 의한 조절가능성을 확인할 수 있었다.
PSP 분해 활성 세균을 이용한 마비성패류독의 생물학적 제독 방법을 확립하기 위하여 진주담치 및 해수에서 마비성패류독 분해능이 있는 균주를 분리하였으며, 분리 균주의 독소 분해 활성 및 세균학적 특성 시험을 실시한 결과는 다음과 같다. 남해안 패류양식장에서 채취한 진주담치 및 해수 중에서 마비성패류독 분해능이 있는 8균주를 분리하였으며, 분리균주 중 $GTX 1{\~}4$ 혼합물 전반에 대하여 폭넓은 분해 활성을 나타낸 CW-6를 시험 균주로 선발하였다. 선발 균주 CW-6는 배양 3일만에 18nmole/g의 GTX2를 완전히 분해하는 강한 독소 분해 활성을 나타내었다. 선발 균주 CW-6는 생화학적 특성 시험 결과, Enterobacter속으로 동정되어 Enterobacter sp. CW-6로 명명하였으며, 이 균주는 $20{\~}40^{\circ}C,\;pH 7{\~}9$에서 왕성하게 증식하는 전형적인 중온세균의 특징과 염분농도 $6{\%}$에서도 최적 증식의 $46.8{\%}$ 정도 증식 가능한 내염성을 나타내었다.
중국에서 약용 및 음용식물로 사용되고 있는 여주 (Mo-mordica charantia L.)를 이용하여 추출, 분획한 후 항균, 항암 및 암예방 효과를 살펴보았다 여주의 MCU층을 제외한 모든 층에서 항균력을 보였으며 특히 Staphylococru aureus의 MCMEE층에서 가장 높은 항균활성을 나타내었다 실험에 사용한 각균에 대한 여주 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종의 인체 암세포 HepG2, HeLa 및 MCF극에서 모두 여주의 ethyleth-er 분획층인 MCMEE와 ethylacetate 분획층인 MCMEA 층에서 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. HepG2세포를 이용하여 암예방 QR 유도 활성을 측정한 결과, 다른 분회층에 비해 비극성 용매층인 hexane 분획층 MCMH에서 아주 높은 QR 유도를 활성시키는 것으로 나타났다. 본 실험 결과, 여주에는 식품 보존과 항균제로서의 개발가능성이 보이며. 항발암 효과를 보기위한 암세포 증식 억제 효과는 ethylether층 MCMEE과 ethylacetate층 MCMEA층에서 월등하였고, 비극성 용매층인 hexane 분획층에는 암발생을 예방하는 quinone reductase inducer가 있는 것으로 사료되며. 나아가 단계적인 생리활성 연구의 분리 동정이 계속 이루어져야 할 것으로 사료된다.
항균 활성이 우수한 예덕나무의 75% 에탄올 추출물을 용매 분획 후 일정 수준의 농도로 액체 배지(tryptic soy broth)에 첨가하여 L. monocytogenes 5 균주를 배양시킨 결과 헥산분획물 20 ppm에서 72시간 동안 증식 저해 효과를 나타내었다. 항균 활성이 우수한 예덕나무 헥산 분획물을 silica gel column chromatography로 1회 분획하여 항균 활성이 우수한 획분 M34를 얻었으며 M34 획분은 50 ppm 수준의 농도에서 실험 균주 모두 증식을 저해했다. 획분 M34를 2회 연속 분리하여 소 획분 M34-4-4를 얻은 후 액체 배지에 첨가하여 L. monocytogenes 2 균주를 접종한 후 72시간 배양한 결과 50 ppm 수준의 농도에서 증식 저해 효과가 나타났으며, M34-4-4을 구조 동정한 결과 linolenic acid로 확인되었다.
본 연구에서는 배추와 양배추 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정하고, glucosinolates 함량을 HPLC로 분석하였다. 또한, MTT assay를 통한 암세포 증식 억제 활성을 측정하였다. 배추와 양배추 에탄올 추출물의 항산화물질로 알려진 총 폴리페놀 함량은 각각 308.48 및 344.75 ${\mu}g$ GAE/g dry weight으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 각각 5.33 및 5.95 ${\mu}g$ QE/g dry weight으로 나타났다. 배추 추출물에서는 progoitrin, glucoalyssin, gluconapin, glucobrassicanapin, glucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin의 총 6개 glucosinolates를 확인하였다. 양배추 추출물에서는 glucoraphanin, sinigrin, glucobrassicin 및 4-methoxyglucobrassicin의 총 4개 glucosinolates를 확인하였다. 배추와 양배추 에탄올 추출물이 AGS 인체 위암세포주, HepG2 인체 간암세포주, LNCaP 인체 전립선암 세포주 증식에 미치는 영향을 MTT assay를 통해 알아보았다. 배추와 양배추 추출물의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 효능이 증가하였다. 또한, 배추와 양배추 추출물을 암세포에 처리하고 배양하는 시간이 24시간에서 48시간으로 길어질수록 암세포 성장 억제 효능도 증가하였다. 배추와 양배추의 추출과정 중에 생성된 glucosinolate 가수분해 산물과 폴리페놀, 플라보노이드 등의 생리활성 물질들이 암세포 성장 억제에 직접적인 영향을 주었을 것으로 사료된다. 한국인들이 자주 섭취하고 있는 배추와 양배추에는 주요 생리활성 물질인 글루코시놀레이트뿐 아니라 폴리페놀, 플라보노이드가 함유되어 있으며, 이들 추출물들은 암세포 증식 억제 효능이 있음을 보여주었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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