양파 조미액으로부터 ACE 저해활성 물질을 분리하기 위해 hexane, ethylether, ethylacetate, butanol과 물로 분획시, 4.8g의 당 함량과 31.9 mg의 phenol성 물질을 함유한 butanol 분획이 82.1%의 ACE 저해활성을 나타내었고, 70.3%의 ACE 저해활성을 보인 양퍄 조미액보다 높은 저해활성을 보였다. Butanol 분획을 Amberite XAD-2column으로 분리한 결과, ACE 저해활성을 보이는 미흡착 분획(F1)를 얻었다. 활성분획 F1을 Sephadex LH-20column으로 분획한 결과, 4개(F1-1,F1-2,F1-3,F1-4)의 분획을 얻었으며, 이중 F1-3 분획의 ACE 저해활성은 93%로 가장 높은 저해활성을 보였다. Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 얻어진 활성분획F1-3을 Supercosil LC-18 column을 이용하여 분리한 결과, 6분대에서 ACE 저해활성을 가지는 단일 peak(F1-3a)를 얻었다. 각 정제 과정에서 얻은 분획들은 전형적인 flavonoid의 band I과 bandII의 피크를 보였다. 또한 ACE에 대한 저해기작은 flavonoid 물질이 보이는 전형적인 비경쟁적 저해양상을 보였다.
구기자, 구기엽, 지골피 추출물을 이용한 요구르트를 제조하여 항산화효과, ACE (angiotensin converting enzyme) 저해 효과 및 ${\alpha}-glucosidase$ 저해 활성을 시험하였다. 구기자 첨가 발효유의 Antioxidants activity는 물 추출물보다 methanol 추출물에서 더 많은 항산화 활성능을 보였으며 특히 구기엽 요구르트에서 83.85%의 높은 활성능을 보였다. 구기자와 지골피 요구르트에서는 각각 47%와 54%내외의 활성능을 나타냈다. 구기자 첨가 발효유의 ACE(angiotensin converting enzyme) 저해 효과는 원재료에서는 물 추출물이 angiotensin converting enzyme 저해능이 높았고, 구기자 요구르트의 경우 물 추출물과 methanol 추출물 모두가 angiotensin converting enzyme 저해능이 높은 것으로 나타났다. 구기자 첨가 발효유의 ${\alpha}-glucosidase$ 저해 활성은 구기자, 구기엽 및 지골피 4% 첨가 요구르트에서 methanol 추출물의 경우 각각 8.2%, 5.6%, 7.3%의 ${\alpha}-glucosidase$ 저해능을 나타냈는데 이들 모두 원재료 보다는 활성 저해능이 큰 것으로 나타났으나 물 추출물의 경우에는 활성 저해능이 거의 나타나지 않았다.
인공재배 매실나무겨우살이의 의약 화장품의 소재 및 산업화 가능성을 검토하기 위해 80% 에탄올 및 증류수 초음파추출물의 Tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 인공재배한 매실나무겨우살이(PM, 동결건조) 및 자연산 굴참나무겨우살이(QM, 열풍건조, $30^{\circ}C$, 7day)의 80% 에탄올, 증류수 초음파추출물에 대한 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과, 물 추출물의 경우 100 ppm의 농도에서 PM과 QM 모두 5분이 경과 하였을 때 PM은 88.37%, QM은 87.69%로 최대치를 나타내었고, 농도와 시간이 증가함에 따라 tyrosinase 저해활성이 감소하는 경향을 보여주었다. PM 80% 에탄올 추출물은 5분이 경과하였을 때 2,500ppm이 92.08%로 최대값을 보여주었고 이후 시간이 지남에 따라 저해활성이 감소되는 경향을 나타내었다. 반면 5,000ppm은 5분이 경과하였을 때 66.38%로 최소값을 나타낸 반면, 20분까지 저해활성이 증가하였고 10분이 경과한 이후로 거의 일정하게 유지되어 지속적으로 감소되는 1,000ppm보다 높은 저해효과를 보여 주었다. QM 80% 에탄올 추출물은 5분이 경과하였을 때 1,000ppm이 88.14%로 가장 높았고 5,000ppm은 63.49%로 가장 낮은 저해활성을 보여주었다. 15분까지 1,000ppm이 가장 높은 저해활성을 보여주었으나 꾸준히 감소한 반면, 2,500ppm의 경우 시간이 경과함에 따라 비교적 일정한 저해활성을 보여주어 15분이 경과한 이후로 2,500ppm의 저해활성이 가장 높게 나타났다. 25분이 경과하였을 때 2,500ppm은 70.27%로 가장 높은 저해활성을 나타내었고, 5,000ppm은 30.09%로 가장 낮은 저해활성을 보여주었다. 본 연구 결과에 따르면, 물 추출물의 경우 겨우살이의 농도가 낮을수록 더 높은 tyrosinase 저해활성을 나타내었고, 80% 에탄올 추출물의 경우 2,500ppm에서 가장 높은 저해활성을 나타내어 의약 화장품의 소재 및 산업화 가능성이 높음을 확인할 수 있었다.
Cysteine 계 cathepsin B 단백질 분해 효소는 고등동물의 세포조직 내에 lysosome에 존재하며 병원성세균의 침입을 막고 불필요한 단백질을 분해시키며 또한 면역세포의 항원인식에 대한 단백질 생산 등에 관여하는 효소이다. 이 cathepsin B의 과량 발현은 암전이, 만성적 염증성 질환, 류머티스 관절염, 노인성치매 등의 원인이 된다. 이 cathepsin B를 저해하는 것으로 밝혀진 S. luteogriseus KT-10으로부터 분리한 저해제 KHS10을 이용하여 분광광도계를 사용, 그 저해력을 조사하였다. Cathepsin B 저해제 KHS10은 경쟁적 저해를 나타내며 cathepsin B는 기질 CLN에 대해 Km 값은 0.5mM을 Vmax 값은 $29.4\mu$M로 나타내었으며, 합성기질인 BANA에 대해서는 Km 값이 2mM을 Vmax 값은 7.8$\mu$M/min로 나타났다. 저해제 KHS10의 Ki 값은 $0.43{\mu}$M로 측정되었다. Cathepsin B에 대한 저해제 KS10의 반응시간에 대한 저해력은 1시간 반응시 저해력이 100%에 가깝게 높게 나타났으며 온도에 의한 저해율은 $25^{\circ}C$에서 활성이 가장 높게 나타났다. Cathepsin B와 저해제 KHS10이 반응 전 배양은 5분간의 전 배양으로 높은 저해율을 나타내었으며 또한 pH에 의한 저해활성은 pH 6.0에서 가장 높게 저해하는 것으로 조사되었다. 저해제 KHS10는 $100^{\circ}C$에서 1시간 열을 가해도 그 잔류 저해력은 80% 이상 유지되었다.
아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해제에 의한 아세틸콜린 분해 억제는 알츠하이머 질병의 가장 확실한 치료 방법 중의 하나로 알려져 있다. 본 연구는 최근 웰빙 건강 소재로 각광을 받고 있는 과일과 채소로부터 새로운 AChE 저해제를 개발하여 항치매 식품이나 대체 의약품 생산에 응용하기 위해 과일과 채소로부터 AChE 저해 활성이 우수한 시료를 선별하고, AChE 저해 물질의 추출조건을 최적화하였다. AChE 저해 활성은 호두의 메탄올 추출물에서 72.6% ($IC_{50}=14.2\;{\mu}g$)로 가장 높았고, 호두의 AChE 저해 물질은 80% 메탄올로 $40^{\circ}C$에서 12시간 동안 처리하였을 때 가장 많이 추출되었다.
고품질의 최소가공 버섯을 제조하기 위해 여러 가지 천연 갈변저해제를 양송이버섯에 적용하여 최적의 천연 갈변저해제를 선발하고 선발된 천연 갈변저해제를 처리한 최소가공 버섯의 저장 중 품질특성 변화를 조사하였다. 천연 갈변저해제 중 천문동, 계피 및 키위 추출물이 우수하였다. 이들 선발된 갈변저해제를 처리한 최소가공 버섯의 저장 중 물리적 품질특성을 조사한 결과 갈변도에서는 1% cysteine과 천문동 추출물이 높은 저해효과를 나타내었다. 천연갈변저해 제를 처리한 버섯의 PPO 활성이 저장 초기부터 높게 나타난 것은 갈변저해제가 양송이버섯의 조직 내부로 흡수되지 못하기 때문으로 보여지며, 갈변저해제에 따른 총 페놀 함량의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 저장기간이 증가함에 따라 양송이버섯의 총 페놀 함량이 증가하였다. 이러한 결과는 현재까지 갈변저해에 주로 이용되던 화학물질을 천연물 유래 갈변저해제로 대체 할 수 있음을 시사하는 것이다.
$121^{\circ}C$에서 15분간 가압살균한 양배추즙액은 미생물번식 저해작용을 나타내기도 하였는데 이 가압살균한 앙배추즙액의 미생물번식 저해작용에 대한 미생물의 감수성은 미생물마다 차이가 있었다. 대체로 그람양성세균 중에서 젖산균은 내성이 컸던 반면 기타 그람양성세균은 내성이 낮았다. 효모의 번식도 대체로 크게 저해를 받았으며 그람음성세균은 비교적 저해정도가 적었다. 가압살균한 기타 다른 채소도 미생물번식 저해작용이 관찰되었다. 희석하지 않은 가압살균한 앙배추즙액에서는 번식 하지 못하였던 S. aureus와 C. utilis가 가압살균한 양배추즙액을 물로 희석한 경우 번식한 것을 보면 번식저해의 원인이 영양분 부족때문은 아닌 것으로 판단된다. 양배추즙의 가열 조건을 달리한 경우의 미생물번식을 보면 $100^{\circ}C$에서 20분, 30분 가열시에는 번식 저해효과가 없었고, $121^{\circ}C$에서 5분, 10분, 15분 가열하였을 때는 번식저해효과가 있었다. 양배추즙을 가열시 발생하는 저해물질은 가열온도가 높고, 가열시간이 길수록 더 많이 생성되었으며, 가압살균한 앙배추즙액에 의한 미생물번식 저해작용은 cysteine과 glutathione에 의해 어느 정도 반전되었다. 가압살균한 양배추즙액을 음이온교환수지처리하면 미생물번식 저해작용이 없어졌으나 이는 양배추의 항미생물성 물질이 높은 pH에서 불안정하였기 때문에 나타난 현상이었다.
우리 나라 전통발효식품인 된장으로부터 angiotensin 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE) 저해활성이 우수한 균주 SYG3를 분리하여 형태학적, 배양학적, 생리학적인 특성을 조사한 결과 B. pumilus 또는 그 유연균으로 동정되었다. 분리 균주의 ACE 저해물질 생산조건을 알아보기 위해 각종 배양조건에 따른 저해활성을 조사한 결과, 탄소원으로서는 glucose, 질소원으로서는 soybean powder에서 가장 높은 저해활성을 나타내었으며, skim milk와 casein에서도 비교적 높은 저해활성을 나타내었다. Soybean powder 농도에 따른 저해활성은 5%(w/v) 첨가시 가장 높은 저해활성을 나타내었으며. 그 이상의 농도에서는 저해활성의 변화가 거의 없었다. NaCl 농도는 3%(w/v) 첨가시 저해활성이 가장 높은 것으로 나타났으며 배양온도는 $32^{\circ}C$, 초기 pH 7.0에서 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 최적배지조건에서의 배양시간에 따른 ACE 저해활성은 배양 36시간에 약 98%로서 최고에 도달하였다.
신규화합물의 in Vitro AChE 저해력을 평가하기 위한 저해시험법의 확립을 목적으로 실험을여 다음과 같은 결과를 얻었다. {TEX}$I_{50}${/TEX} 산출이 가능한 고정시간 저해시험(fixed time inhibition test)의 경우, DFP, DDVP 및 paraoxon과 같은 대표적 AChE 저해제의 저해력 평가에 적당한 저해시간은 10분 정도로 조사되었으며, 10분간의 저해조건하에서 ester group을 보유한 신규화합물의 저해여부 및 정도의 평가에 효과적인 시험농도는 10$\mu$M 수준으로 판정되었으나 다른 화합물의 경우에는 보다 높은 농도로부터 단계적 저해시험이 필요한 것으로 보였다. {TEX}$K_{d}${/TEX}, {TEX}$k_{3}${/TEX} 및 {TEX}$k_{i}${/TEX}와 같은 저해상수의 산출을 위한 경시적 저해시험(Progressive inhibition test)에 있어서, 본 실험의 장시간 저해(0.8~13.3분)와 낮은 저해제농도(1$\times${TEX}$10^{-9}${/TEX}~2$\times${TEX}$10^{-6}${/TEX}M)의 조건하에서는 극히 낮은 {TEX}$K_{d}${/TEX}(1.3$\times${TEX}$10^-{8}${/TEX}~5.6$\times${TEX}$10^{-7}${/TEX}M) 및 {TEX}$K_{3}${/TEX}(0.21~{TEX}$0.27min^{-1}${/TEX})가 관찰되었으나 저해제간의 저해독성 조사에는 충분한 타당성을 가지는 것으로 조사되었다. 또한 DFP, paraoxon 및 신규화합물인 KH501간의 현격한 저해력 차이는 {TEX}$K_{d}${/TEX}의 차이 즉, 저해제와 AChE간의 친화력 차이에 기인된 것으로 판명되었다. 따라서 AntiChE 스크리닝에 있어서 1차단계에서는 고정시간 저해법을 통하여 산출된 {TEX}$I_{50}${/TEX}를 바탕으로 하여 저해력 유무 및 정도를 파악하고, 1차단계에서 고도의 AChE 저해력이 인정된 신규 화합물을 대상으로 2차단계인 경시적 저해법을 이용하여 저해양상 및 특성을 조사하는 것이 합리적인 체계일 것으로 생각되어진다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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