• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제54권2호
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• pp.94-100
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• 2011

Bacillus licheniformis로 부터 phospholipase D (PLD)로 추정되는 유전자를 PCR 기술을 이용하여 분리하여 pGEM-T easy 운반체에 cloning 하였다. 분리된 유전자는 His6가 붙은 pET-21 운반체를 이용하여 E. coli BL21 (DE3)에서 발현시켰다. 재 조합된 PLD는 nikel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin을 갖는 column을 이용하여 affinity chromatography로 분리하였다. SDS-PAGE 분석 결과 PLD로 추정되는 단백질은 약 44 kDa의 주요 단일밴드를 나타내었다. 분리된 효소의 최적 활성도는 pH 7.0에서 나타났으며 이 조건에서 또한 효소가 제일 안정되었다. 효소활성에 미치는 최적 온도는 $40-45^{\circ}C$의 온도에서 형성되어 비교적 높은 온도를 나타내었으며 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다. 여러 가지 detergent 중에서 Triton X-100을 0.6 mM까지 첨가할 경우 PLD의 효소활성도는 점진적으로 증가하여 대조구 대비 최대 181%의 효소 활성도를 나타내었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권2호
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• pp.155-161
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다. Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다. 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.5와 $50^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였고 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 셀룰로스, 만난과 para-nitrophenyl-${\beta}$-xylopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. Xyn11B의 활성은 $Ca^{2+}$과 $Mg^{2+}$에 의해서는 약간 증가한 반면에 $Cu^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 크게 저해되었고 SDS에 의해서 완전히 저해되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권3호
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• pp.226-235
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• 2017

Phytoene, lycopene, ${\beta}-carotene$과 같은 카로티노이드는 식품의 착색제나 영양보조제, 사료첨가제, 화장품의 원료로 사용된다. 이전 연구에서 본 연구진은 분홍색의 색소를 생산하는 새로운 해양 세균인 K. gwangalliensis를 분리 동정하였다. Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K. gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝 하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E. coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K. gwangalliensis CrtI의 1차 구조에 대한 폭 넓은 지식 기반을 제공할 것이다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제51권2호
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• pp.142-146
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• 2013

최근 국내 농촌진흥청 국립농업과학원 연구팀에서 농가보급품종인 백옥잠(잠123 ${\times}$ 잠124)을 이용하여 피브로인 중쇄 유전자 내에 녹색형광유전자(EGFP)를 도입하여 녹색형광 누에고치를 생산하는 형질전환누에 개발에 성공한 바 있다. 그리고 녹색형광 누에고치는 견사의 주성분인 fibroin heavy chain 유전자에 삽입된 형광유전자의 발현으로 정련을 해도 형광단백질의 고유한 색깔이 그대로 유지되며, 자연광 하에서도 도입 형광유전자 고유의 형광색을 나타낸다. 그러나 형광누에고치는 기존의 $100^{\circ}C$ 내외의 고온 처리에 의한 건조, 자견 및 조사 방법을 이용하면 형광단백질에 심각한 변성이 초래되고 이로 인해 형광색깔을 잃게 되는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 녹색형광 누에고치로부터 녹색형광단백질의 변성을 초래하지 않는 누에고치의 저온건조 방법, 저온 진공 감압 처리에 의해 고치 내강 내 침지액 침투방법 및 조사방법을 개발하여, 녹색형광 누에고치로부터 천연의 녹색형광색을 띄는 생사를 생산하였다. 그리고 이들 생산된 녹색형광 생사는 별도의 염색처리 없이 패션의류, 벽지, 조명등갓, 액세서리, 인테리어용품 등의 고부가가치 실크소재로 적용이 기대된다.

• KSBB Journal
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• 제24권1호
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• pp.80-88
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• 2009

glandular kallikrein에 광범위한 상동성을 가지는 인간 전립성 산성 인산 가수분해 효소는, 전립선암의 대표적인 혈청 biomarkers이다. 수지상세포는 유력한 항원 제시 세포이며, 바이러스, 미생물 병원체 및 종양에 대하여 면역 계통에서 강력한 T 세포 응답을 유도할 수 있다. 따라서, 종양 특이적인 항원으로 감작된 수지상세포를 이용한 면역요법은 anti-tumor 면역 유도를 위한 강력한 방법중의 하나이다. 크레아젠(주)에서 개발된 CTP (세포막 투과성 펩티드) 기술은 세포 내로의 높은 침투 효율성을 가지며 핵산이나 단백질과 같은 생체 고분자 물질을 접합하여 세포내로 수송할 수 있는 기술이다(36). 하지만 활성형의 인간 전립성 산성 인산 가수분해 효소는 세포사멸을 매개할 수 있기 때문에, 본 연구진은 항암 치료용 백신으로의 수지상세포 감작을 위해 비활성형 형태의 다중체 (multimer) 항원을 개발하였다. 본 연구에서, 수지상 세포의 감작과 활성화에 안전하고 효율적인 다중체 형태 (multimeric form)의 세포막 투과성 펩티드가 융합된 인간 전립성 산성 인산 가수분해 효소를 얻기 위한 정제공정을 기법을 개발하였고 젤 여과 크로마토그래피, western blot과 Dynamic Light Scattering을 이용하여 확인하였다. 아울러, 정제된 다중체 형태 (multimeric form)의 세포막 투과성 펩티드가 융합된 인간 전립성 산성 인산 가수분해 효소는 수지상 세포의 감작시 세포질 내로 효과적으로 침투되었다. 결과적으로 세포의 사멸의 부작용이 없이 MHC class I 분자를 통해 수지상세포의 표면으로 효과적으로 제시되었다.

• Journal of Periodontal and Implant Science
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• 제37권1호
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• pp.35-44
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• 2007

Periodontal ligament (PDL) is the connective tissue located between the tooth root and alveolar bone. In a previous study, PDLs22 was isolated as a PDL-specific gene by using subtractive hybrid-ization between cultured PDL fibroblasts and gingival fibroblasts. It was also suggested that PDLs22 plays important roles in the development, differentiation and maintenance of periodontal tissues. However, little is known about functional study of PDLs22 using recombinant protein in PDL fibroblast differentiation and periodontium formation. In this study, in order to produce the PDLs22 recombinat protein, PDLs22 expression vector were constructed and expressed its protein in various host cell and temperature conditions. The results were as follows: 1. PDLs22 protein was not strongly expressed In the induction system using pRSET-PDLs22 construct. 2. When the BL21(DE3) pLysS was used as a expression host, PDLS22 protein was strongly ex-pressed in the induction system using pHCEIIBNd-PDLs22 construct. 3. The PDLs22 protein was recognized at a molecular weight of 28 kDa in western blots. 4. Almost of the expressed PDLs22 protein was not soluble and observed like as inclusion body. 5. The protein solubility was not improved after modification of induction time and temperature during PDLs22 protein production. In this study, the system for the PDLs22 protein production was connstructed. However, the re-results suggest that further studies will be needed to produce the considerable amount of PDLs22 re-combinat protein, which can use for the periodontal regeneration.

• 한국균학회지
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• 제26권4호통권87호
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• pp.450-457
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• 1998

Cryparin은 Cryphonectria parasitica의 세포벽에 풍부한 소수성 단백질에 속한다. cryparin은 비록 하나의 유전자에 의해 발현되지만 액체배양 후 48시간이 지나면 발현된 전체 유전자중에서 22%를 차지할 정도의 높은 발현 양상을 나타낸다. 또한 cryparin은 RNA mycovirus인 Cryphonectria hypovirus 1의 감염에 의해 발현이 현저히 억제되는 유전자로 알려졌다. 이미 지난 실험(Kim et al., 1999)에서 상동염색체간의 재조합을 이용하여 cryparin 유전자를 항생제 hygromycin B 저항성 유전자로 치환한 치환체를 제조하였다. 발현율이 매우 높으면서도 virus에 의해 밀접하게 영향받는 cryparin 유전자의 promoter 분석을 위하여서는 대상이 되는 유전자 치환을 위한 vector만을 포함하며, 분석에 이용될 여러 유전자 운반체들이 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 가진 균주의 개발이 필요하다. 그러나 지난번 실험의 결과 얻어진 cryparin 치환체는 치환용 vector외에도 무작위로 삽입된 vector가 존재하고 나아가 새로운 vector들이 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 갖지 못하였다. 따라서 본 실험에서는 cryparin 유전자 치환체와 영양요구성 돌연변이체인 균주간의 교잡을 이용하여 분석 대상이 되는 유전자의 치환에 이용된 vector만을 포함하며, 분석에 이용될 여러 유전자 운반체들이 genome내의 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 가진 균주를 제조하였다.

• KSBB Journal
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• 제11권1호
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• pp.8-14
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• 1996

Bacillus subtilis를 재조합이종 단백질 생산에 응 용하고 그 발현효율의 향상을 위하여, aprE 프로모 터를 모델계로서 이에 작용하는 전이상태 조절유전 자 변이와 포자형성변이의 영향을 살펴보았다. 사용 된 균주는 두 개의 프로테아제가 제거된 DB104이며, 조절인자 변이주는 $degU^h$와 hpr을 각각 활성인자와 억제인자로 선택하였고, 이중변이주는 DB104 ($\DeltaspoIIG(Pm) degU^h his^+$) 및 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) \Deltahpr(Em)$) 를 제조하였다. 이에 목적유전 자연 aprE유전자를 재조합하여 변이에 의한 과발현 양상을 확인하였다. degUh 및 hpr 조절변이주는 야 생주와 비교하여 각각 약 7배 빛 약 2배의 발현효율 향상을 보여주었다. 이들 전이상태 조절유전자 변이 는 모두 목적유전자 복제 수의 증가에 따라 발현효 율의 감소를 나타내어 증폭된 목적유전자에 대한 조 절유전자의 희석효과(gene dosage effect)를 확인할 수 있었다. 이중변이주 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) degU^h his^+$)::pMK101 및 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) \Deltahpr(Em)$)::pMK101에서의 aprE 발현은 각각 약 10배 빛 3배의 발현증가를 가져와 aprE 발현에 대한 포자변이주 및 전이상태 조절유전자의 독립적인 부가효과를 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권4호
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• pp.287-293
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• 2002

병독성 대장균 (K88ac)의 pilin gene을 분리하여 이를 당근에 도입한 후 이의 발현을 유도하여 자돈 설사병 예방 및 치료를 위한 당근경구백신 개발을 목적으로 하였다. 형질전환을 통해 494 세포주를 확립하였고, western분석을 통하여 0.1~4 $\mu\textrm{g}$/g의 pilin 단백질 발현을 확인하였으며 백신식물 생산에 적합한 세포주 2종 (M1-17, Y14-1)을 선발하여 포장생산 및 임상실험에 적용하였다. 쥐를 대상으로 당근 경구 투여시 병원균 항체 생성 여부와 면역 유도를 위한 최적 농도 지표를 파악하기 위하여 1주 간격으로 형질전환 당근 1g, 3g, 5g을 경구투여 한 결과 백신 당근 3g 투여시 10$\mu\textrm{g}$의 재조합 pilin 백신을 경구 투여한 것에 비해 다소 높은 항체 생성을 나타냈으며 3g의 분량이 쥐 면역 유도를 위한 적정량으로 확인하였다. 자돈에 대한 백신당근 경구 투여시 자돈 설사병 보호 효과를 정량적으로 구명하기 위하여 분석한 자돈의 일당 증체량은 형질전환 당근 투여시 평균 60g 이상 더 높은 증체량을 보였으며, 질병방제 효과를 구명하기 위하여 장독성 병원균을 인위 접종한 결과 대조구에서만 fecal score 3의 심각한 설사를 확인하였다. 본 연구를 통해 개발된 당근백신은 효율적 투여방법 등에 대한 후속 실험을 통하여 산업적 이용 가능성이 탐색될 예정이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권1호
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• pp.42-48
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• 2011

고등식물의 엽록체 유전공학은 핵 형질전환과 비교해 볼때 여러 가지 독특한 장점을 가진다. 높은 transgene 발현율, 상동 재조합에 의한 site-specific transgene의 삽입으로 인해 유전자의 position effect가 없으며, 단일 형질전환으로 동시에 여러 유전자의 도입이 가능하고 모계 유전으로 인해 화분 방출 위험을 감소시킬 수 있다. 담배 specific한 pCtVG (trnI-Prrn-aadA-mgfp-TpsbA-trnA) 벡터를 이용하여 안정적인 감자 엽록체 형질전환 시스템을 개발하였다. 감자 엽록체 게놈으로 외래유전자의 삽입과 homoplasmic level은 PCR과 Southern blot 분석으로 확인하였다. Northern과 immunoblot 분석 및 GFP fluorescence imaging을 통하여 엽록체 형질전환체의 잎에서 GFP 유전자가 강하게 발현, 축적됨을 알 수 있었다. 본 연구에서 확립된 감자 엽록체 형질전환 시스템을 이용하여 유용 유전자를 도입함으로써 농업적 형질을 개선하거나 고부가가치 단백질을 대량 생산하는 감자를 보다 효율적으로 개발할 수 있을 것이다.