• 한국미생물·생명공학회지
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• 제13권4호
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• pp.349-354
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• 1985

Plasmid pBR322와 runaway Plasmid pSY343을 vector로 사용하여 E. stearothermophilus IAM 11062내의 $\alpha$-amylase 유전자를 E. coli내에 클로닝 하였다. 이때 얻어진 $\alpha$-amylase유전자는 제한효소 Hind III의 말단을 갖고 있는 4.7kb의 크기였으며 E. coli내에서 이들 유전자는 비교적 안정적 있게 유지되고 발현되었다. 재조합 $\alpha$-amylase유전자가 클로닝된 E. coli는 B. stearothermophilus IAM 11062보다 3배의 $\alpha$-amylase를 더 많이 생성하였다. EDTA를 사용한 osmotic shock 방법에 의하여 E. coli내에서 생성된 $\alpha$-amylase는 그 효소 생성량의 75%정도가 periplasm에 존재함이 밝혀졌다. 재조합된 $\alpha$-amylase 유전자에 의해서 E. coli에서 생성된 $\alpha$-amylase는 최적 작용온도가 55$^{\circ}C$로서 이들의 열안정성과 분자량(61,000)도 B. stearothermophilus IAM 11062의 $\alpha$-amylase와 거의 동일하게 나타나 E. coli와 B. stearothermophilus IAM 11062에서 생성된 $\alpha$-amylase는 효소학적 성질이 같음을 보여주었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권6호
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• pp.479-485
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• 1986

Bacillus amyloliquefaciens가 생성하는 액화형 $\alpha$-amylase의 구조유전자를 클로닝하기 위하여 이 균주 염색체의 2 - 5kb 획분을 분리하여 Mbo I으로 부분분해한 후 pUB110플라스미드의 BamHI 부위에 삽입하여 hybrid vector pSKS3 를 제작하였다. 이 재조합플라스미드를 세한수식결손 세포인 Bacillus subtilis ED 107에서 subcloning한 후 당화형 $\alpha$-amylase를 생성하는 Bacillus subtilis NA 64의 $\alpha$-amylase결실변이주 Bacills subtilis KM 107 주에서 형질 발현시켰다. 이때 형질전환빈도는 $10^{-5}$ - $10^{-7}$정도였으며 그중 약 50%가 $\alpha$-amylase 분비능이 있었으나 거의 대부분이 쉽게 실활되었다. 최종선별과정에서 $\alpha$-amylase를 가장 강하게 생성하는 형질전환주 Bacillus subtilis KM213으로부터 재 추출한 재조합플라스미드 pSKS3는 5.7kb 삽입된 단편이 BamH I/Mbo I 부위에 결합되어 있었다. pSKS3에 클로닝된 유전자에 의해 발현되는 $\alpha$-amylase 활성은 B. amyloliquefaciens 활성의 약 25%였으며, 이 pSKS3에 의해 발현되는 $\alpha$-amylase 단백은 B.amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase와 동일한 전기영동성을 나타내었음을 볼 때 pSKS3에 클로닝된 유전자는 B. amyloliquefaciens에서 유래함을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제21권1호
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• pp.96-101
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• 2011

ATP와 L-methionine으로부터 SAM synthetase (MetK)에 의해 생합성 되는 S-adenosylmethionine (SAM)은 세포내 메틸화에 필요한 메틸기를 제공하는 중심적인 공급체의 역할을 할뿐만 아니라 방선균에서는 일차 및 이차대사산물의 생산 조절에 관여하고 있다는 사실이 밝혀졌다. 이에 논 연구에서는 산업적으로 매우 중요한 항진균성 항생물질인 natamycin을 생산하는 S. natalensis로부터 SAM synthetase 코드하는 metK 유전자를 클로닝하고 동정하였다. S. natalensis에서 클로닝된 metK는 1,209 bp의 염기를 가진 유전자로써 아미노산서열에서 S. pristinaespiralis ATCC 25486과 S. peucetius ATCC 27952의 MetK와 96%, S. violaceusniger Tu 4113과 95% 일치하는 매우 높은 상동성을 보였다. 또 pSET152ET 벡터를 이용해 구축한 metK 고발현용 재조합 플라스미드 pCD1를 S. lividans TK24의 genomic DNA에 도입하여 actinorhodin 생산 유도를 시도해 본 결과 R5 고체배지에서 pCD1이 도입되지 않은 균주에서는 actinorhodin 생산을 전혀 확인할 수 없었지만 pCD1이 도입된 형질전환체에서는 actinorhodin 생산이 강하게 유도되었으며 R4 액체배지에서는 actinorhodin 생산량이 10배 증가되었다. 따라서 본 연구를 통해 클로닝된 S. natalensis 유래 metK 유전자는 방선균에서 이차대사산물의 생산을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

• 유기물자원화
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• 제15권3호
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• pp.80-89
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• 2007

셀룰로오스 가수분해효소의 하나인 endo-${\beta}$-1,4-D-glucanase의 유전자를 지렁이 Eisenia anderi의 중장으로부터 클로닝하여 EaEG2와 EaEG3로 명명하였다. 두 유전자의 염기는 1368bp이며, 개시코돈을 포함하여 456개의 아미노산을 코딩한다. N-말단 지역의 20개 잔기들은 signal peptide이다. 두 유전자의 전체 아미노산 염기서열은 glycosyl hydrolase family 9에 속하며, 같은 종류의 셀룰로오스 가수분해효소를 분비하는 흰개미, 바퀴벌레, 가재 그리고 연체동물과 51-55%의 높은 상동성을 보였다. 지렁이의 EaEG2와 EaEG3는 가수분해활성에 중요한 세 부분이 잘 보존되어 있다. 아미노산 염기서열을 이용한 계통수 분석에서 GHF9 그룹은 절지동물, 박테리아, 식물, 환형동물 및 연체동물의 5개 그룹으로 분석되었다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제52권1호
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• pp.15-20
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• 2009

포플러는 naringenin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin, rhamnetin, quercetin과 같은 플라보노이드를 가지고 있다. 이러한 플라보노이드들은 여러 가지 효소에 의해 naringenin으로부터 합성된다. 그러나, 포플러에서는 플라보노이드 합성에 관여하는 효소들의 연구가 거의 이루어지지 않았다. 포플러에서 flavone synthase I 유전자를 RT-PCR방법을 이용하여 클로닝하였다. PFNS I-1 유전자의 기질 특성을 알아보기 위하여 대장균에 과발현하여 glutathione S-transferase 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제한 PFNS I-1 재조합 단백질은 flavanone인 2S-naringenin기질을 이용하여 flavone인 apigenin을 생성함을 알 수 있었다. 또한 cofactor인 oxoglutarate, $FeSO_4$, ascorbate, catalase가 PFNS I-1의 반응성에 중대한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 PFNS I-1 유전자는 flavone synthase I을 암호화하는 유전자임을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제30권1호
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• pp.1-7
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• 1992

Pseudomonas sp. DJ77 의 chromosomal DNA로 부터 6-8kb XhoI 절편 상에 존재하는 phenanthrene 분해에 관련된 유전자군을 vector pBLUESCRIPT SK(+)에 클로닝하였다. 이렇게 얻은 재조합 plasmid인 pHENX7을 가지고 있는 JM101 균주는 3-methylcatechol을 노란색의 meta-cleavage 화합물로 전환학 수 있었다. 그러자 삽입된 절편의 방향이 반대가 되도록 제조한 pHENX7R 은 extradiol dioxygenase 활성을 나타내지 않기 때문에 전사방향을 알 수 있었다. pHENX7과 이의 유도체들을 지니는 JM101 균주에서 PhnC(24kDa), PhnD(31 kDa), PhnE(34 kDA), PhnF(15 kDa) 의 4 polypeptide 를 확인학 수 있었고 개개의 유전자의 위치와 범위를 알 수 있었다. 유전자 순서는 phnC-phnD-phnE-phnF-phnG 이었으며, phnD, phnE, phnG 는 각기 gluthione S-transferase, meta-cleavage compound hydrolase, extradiol dioxygenase, metacleavage compound dehydrogenase 의 유전자이었다.

• 생명과학회지
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• 제27권5호
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• pp.524-529
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• 2017

본 연구에서는 zebrafish에 인간의 KCNE1 유전자가 삽입된 형광단백질 vector를 microinjection하고, 그 발현 여부를 확인하고자 하였다. 먼저 양 말단에 제한효소(EcoRΙ, BamHΙ) site를 넣어 제작한 primer들로 genomic DNA에서 KCNE1 유전자를 분리하였다. 그 결과는 약 402 bp 크기의 DNA band였고 이 PCR 산물을 형광단백질 vector인 pPB-CMVp-EF1-GreenPuro 속에 클로닝하여 pPB-CMVp-hKCNE1-EF1-GreenPuro plasmid를 제작하였다. 이렇게 준비된 형광 vector를 zebrafish 수정란에 microinjection하였고, 부화된 치어에서 RT-PCR과 DNA sequencing을 통해 GFP 및 hKCNE1의 발현을 최종 확인하였다. 본 연구는 향후 QT 연장증후군(LQTs)에 대한 동물 모델로써 신경자극 전도, 유전자 치료, 유용 유전자 클로닝을 위한 기술 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제52권1호
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• pp.39-44
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• 2014

효율적인 형질전환 누에 시스템 구축을 위해서는 새로운 전이인자의 개발과 함께 선발을 위한 마커 유전자 및 transposase 발현을 효과적으로 조절할 수 있는 다양한 유전자 프로모터 개발이 필수적이다. 이와 관련하여 선행연구를 통해 누에 후부실샘으로부터 고발현하는 RNA binding protein-1 homologue(RBP-1) 유전자를 선발한 바 있다. 본 연구에서는 RBP-1유전자의 누에 발육시기별 및 유충 조직별 발현양상을 Northen blot hybridization 방법으로 분석한 결과, RBP-1 유전자는 유충기로부터 번데기 후기까지의 전기간에 걸쳐 발현하였으며, 두부, 표피, 중장, 지방체 및 견사선 등 실험한 모든 유충 조직에서 고발현 하는 것으로 관찰되었다. 또한, 누에 게놈 유전자은행을 제작한 후 RBP-1 cDNA 유전자를 탐침으로 5'-UTR 영역을 클로닝하고 luciferase assay 방법으로 RBP-1 유전자 프로모터의 활성을 분석하였다. 실험 결과, RBP-1 cDNA를 탐침으로 RBP-1 유전자 ORF와 5'-UTR이 포함된 약 1,660 bp 영역의 게놈 유전자를 클로닝하였다. RBP-1 유전자 프로모터 활성검정을 위해 전사 개시점(+ 30)으로부터 상류의 -740 bp 영역을 PCR로 분리한 후 pGL3 basic vector에 도입하여 luciferase 활성 측정을 위한 전이벡터, pGL-RBP1를 제작하였다. 제작된 pGL-RBP1는 곤충 세포주(Sf9)에 transfection 한 후 luciferase 발현량을 측정한 결과, 기존의 BmA3 유전자 프로모터 대비 10% 가량 높은 발현 효율을 확인할 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제33권2호
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• pp.86-91
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• 1997

Pseudomonas sp. DJ77로부터 클로닝된 glutathione S-transferase 유전자(phnC)의 염기서열을 결정하였다. 603bp의 open reading frame(ORF)이 존재하였고 개시코돈 앞에서 Shine-Dalgarno sequence를, 종결코돈 뒤에서는 terminator sequence를 발견하였다. phnC 유전자에서 만들어지는 phnC 단백질은 21,416 Da으로 SDS-polyacrylamide gel 전기영동 결과와 일치하였다. PhnC는 Bulkholderia cepacia LB400, Cycloclasticus oligotrophus RB1의 GST와 각각 53.7%, 49%의 높은 상동성을 나타냈다. 아미노산 서열의 상동성과 필수잔기들의 존재유무로 판단할 때 PhnC GST는 theta class GSTs와 진화적으로 유연관계가 높았지만 alpha, mu, pi, sigma class GSTs에서 구조적, 기능적으로 중요하다고 알려진 아미노산 잔기들이 PhnC GST에도 보존되어 있었다. 또한, phnC 유전자의 위치가 C. oligotrophus RB1, B. cepacia LB400 등의 GST 유전자 위치와 유사하다는 점에서 PhnC 효소는 난분해성 방향족 탄화수소의 분해에 관여하는 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제25권5호
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• pp.507-514
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• 2015

D-Xylulose는 nonoxidative pentose phosphate 경로를 통해 glycolysis 과정으로 들어가기 전에 D-xylulose kinase에 의해서 D-xylulose-5-phosphate로 인산화 된다. K. gwangalliensis strain SJ2로부터 D-xylulose kinase (XK)를 암호화하는 유전자는 E. coli를 이용하여 서열분석 및 발현 하였으며, XK 유전자의 염기서열 1,419 bp로 구성되어 있으며 463개의 아미노산 잔기를 암호화하고 있다. 분석결과를 통해 XK 유전자가 진화과정 동안 잘 보존되었음을 보여 주었다. XK 유전자의 발현을 위해 pCold-II 발현 벡터에 클로닝 하였으며 클로닝 된 플라스미드는 E. coli strain BL21 (DE3)에 형질전환 하여 IPTG를 이용해 발현을 유도하였다. 재조합 된 XK 단백질의 크기는 약 48 kDa이었다. 이 발현된 단백질은 affinity chromatography를 이용하여 정제하였으며 D-xylulose kinase에 따른 enzymatic activity를 분석하였다. D-xylulose와 ATP로 실행한 XK enzyme kinetic 연구는 각각 250±20 μM과 1,300±50 μM의 Km value를 보였다. 본 연구를 통해 얻어진 결과는 분자적 수준에서 D-xylulose kinase의 특성연구의 보다 넓은 지식적 기초를 제공할 것으로 사료된다.