• 한국응용곤충학회지
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• 제32권3호
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• pp.300-306
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• 1993

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1으로부터 생산된 살충성 내독소 단백질을 coding하는 CryIIA 유전자를 클로닝하고 염기서열을 조사하였다. HD-1 균주의 12개 plasmid 중 225kb plasmid를 분리하여 CryIIA 유전자를 포함하는 5kb HindIII 절편을 hybridization하여 찾아냈다. 이 절편을 plasmid pUC19에 ligation하여 E. coli에 형질 전환하였다. 이 독소 유전자를 포함하는 4kb BamHI-HindIII 절편은 vector pT7-5에 ligation하여 pSKIIA라하였다. pSKIIA는 3개의 open reading frames(orf1, orf2, orf3)로 구성되어 있으며 염기서열은 3,952base로 되어 있었다. 이러한 3개의 orf 각각의 발현 여부를 확인하기 위하여 생물검정을 하였다. 그러나 orf1 또는 orf2에 의한 형질 전환체는 독성이 없는 것으로 나타났다. orf3를 포함하는 형질 전환체는 3종의 나비목 곤충(배추점나방, 담배거세미나방, 담배나방) 및 1종의 파리목 곤충(집모기) 유충에 대하여 독성을 나타내었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권2호
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• pp.118-122
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• 1995

Escherichia coli의 오르니틴 트란스카바밀라제는 오르니틴과 카바밀인산으로부터 시트룰린의 합성을 촉진시키는 효소이다. 이 효소의 기능과 구조와의 상관관계, 반응메카니즘 등 생화학적 연구를 하기 위하여 대량의 효소를 추출할 필요가 있다. 본 연구는 오르니틴 트란스카바밀라제의 대량생산 시스템을 확립하기 위하여 E. coli argI 유전자를 E. coli $DH5{\alpha}$ 세포의 염색체 DNA를 추출한 후에 PCR 방법으로 증폭시켜 얻었다. 증폭된 argI 유전자를 단핵생물 단백질 발현벡터인 pKK223-3에 접합시킨 후, 오르니틴 트란스카바밀라제가 존재하지 않은 E. coli TB2 세포에 클로닝 시켰다. 이 세포로부터 생산된 오르니틴 트란스카바밀라제는 암모늄염에 의한 분할, 열변성, 크로마토그래피 등을 사용하여 순수하게 분리하였다. SDS 단백질 전기영동 결과 약 38 kDa 크기의 효소가 순수하게 얻어졌다. 반응속도론적 실험결과 $K_{cat}$은 $1{\times}10^5m^{-1}$, $K_M$은 오르니틴에 대하여는 0.35 mM, 카바밀인산에 관하여는 0.06 mM이 각각 얻어졌다. 이 결과는 야생형 오르니틴 트란스카바밀라제의 반응속도 인자들과 비슷한 값이다. 본 연구는 이들 결과로부터 오르니틴 트란스카바밀라제의 기능을 하는 E. coli argI 유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제32권4호
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• pp.264-270
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• 1994

세균의 RNA 중합효소에서 여러 ${\sigma}$ 인자들 간에 보존된 아미노산 서열중 2.3 부위와 4.2 부위의 아미노산 서열로부터 유 n하여 두가지의 PCR primer를 제작하였다. 이들을 이용하여 PCR을 수행하였을 때, E. coli와 Streptomyces coelicolor의 DNA로부터 예상되었던 480 bp 정도의 DNA가 증폭되는 것을 관찰하였다. E. coli DNA에서 증폭된 DNA를 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 E. coli의 rpoS 유전자로부터 유래하였음을 알았다. 이를 탐침으로 S. coelicolor에서 genomic DNA hybridization을 수행하였을 때, PvuII 절편 두가지 (3.5 kb, 2.0 kb) 와 SalI 절편 두가지(3.4kb, 1.5 kb)에 탐침이 결합하는 것을 관찰하였다. 3.5 kb의 pvuII 절편을 sublibrary로부터 클로닝하고, 탐침이 결합하는 1.0kb의 BamHI/HincII 절편의 염기서열을 분석하였다. 부분적으로 결정된 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank와 EMBL, PDB 등의 data library의 유전자들과 비교하여 본 결과Streptomyces속의 ${\sigma}$인자들을 비롯한 Synechococcus종, Anabaena종, Pseudomonas aeruginosa, Stigmatella aurantica 등의 주된 ${\sigma}$ 인자와 높은 유사성을 보였다. 현재까지 1.2 부위와 4 부위에 해당하는 부분의 염기서열을 결정하였는데, 이 부분은 S. coelicolor에서 알려진 다섯가지의 ${\sigma}$ 인자 유전자 중 hrdA와 가장 높은 유사성을 보이며, 아미노산의 유사성이 1.2부위에서는 88%, 4 부위에서는 75%인 것으로 나타났다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권5호
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• pp.380-387
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• 1997

Pectate lyase isoenzymes을 분비하는 Erwinia carotovorn subsp. carotovora LY34는 식물조직을 연화시키는 연부균이다. 이 균주로부터 게놈 DNA를 분리하여 Sau3Al 제한효소로 부분 절단한 다음 pBluescript $SK^+$ 벡터에 클로닝하여 pectate Iyase를 분비하는 클론을 분리하였다 분리 결과 4.2 kb크기의 DNA 단편을 가지고 있었으며 이를 다시 재클로닝하여 3.1 kb크기의 pelCI유전자를 함유하는 pLYPA100을 구하였다. 이 유전자의 DNA 염기서열을 분석한 결과 374 개의 아미노산을 구성하는 1,122 bp의 ORF를 확인하였다. 시작코돈과 종결코돈은 ATG와 TAA였으며 초기 서열 22개의 아미노산으로 구성된 전형적인 원핵세포의 signal peptide가 존재하였다. PeICI의 단백질 염기서열을 다른 단백질과 유사성을 분석한 결과 Erwinia carotovera subsp. carotovora Er 균주의 PelIII, Erwinia carotevora subsp. carotovora SCR193 균주의 PeIC 및 Erwinia caretovora subsp. atroseptica C18 균주의 Pel3과 유사하였으며 PLbc family에 속하였다. PeICI의 분자량은 40,507, pI는 7.60으로 계산되었다.

• 한국버섯학회지
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• 제2권3호
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• pp.145-148
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• 2004

이 연구는 약용버섯 번데기 동충하초로부터 특이적 자실체 형성 유전자를 선별하기 위하여 수행하였다. cDNA는 버섯의 분화 4단계 균사체, 원기, 미성숙 자실체, 성숙한 자실체로부터 분리한 각각의 total RNA를 이용하여 합성하였다. 특이적으로 발현된 유전자의 선별은 cDNA와 랜덤한 primer set을 이용한 DD-PCR에 의해 수행되었고, pGEM 클로닝 벡터를 이용하여 6개의 partial 유전자 서열을 확인하였다. 6개의 DD-PCR product는 보고된 유전자와 유사도를 확인하기 위해 NCBI BLAST search를 사용하여 GenBank에서 비교하였고, 6개의 유전자는 보고되지 않은 유전자임을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제41권4호
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• pp.306-311
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• 2005

Lumazine protein은 lux operon의 하류 영역에 존재하는 riboflavin synthase와 아미노산 상동성을 보일 뿐만 아니라, riboflavin synthase의 기질인 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine (lumazine)과 결합하여 청록색의 형광을 내게 하는 형광 단백질이다. 발광세균 Photobacterium phosphoreum의 lumazine protein을 코드하는 유전자의 염기서열을 결정하였는데, 이 유전자는 lux operon의 656 bp 상류의 영역에 존재하며, lux operon과는 서로 반대 방향으로 전사되는 것으로 나타났다. 중합효소 연쇄 반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)의 방법으로 아미노-말단 절반 lumazine protein을 코드하게 되는 유전자(lumP-N)를 클로닝하여 형질전환의 방법으로 대장균에 유전자를 전이시켜 이들의 유전자의 발현 양상을 조사하여 보았는바, lumP 전체 유전자(lumP-W)가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드에서는 발현이 매우 미약한 반면에 아미노 -말단(lumP-N)이 들어있는 경우는 과발현됨을 보였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.443-448
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• 1996

xylA 유전자의 프로모터상에서 조절양상을 조사하기 위하여 xylA 유전자의 프로모터(Pxyl)와 lacZ 유전자를 연결한 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 제작하여 xylose에 의한 ${\beta}-galactosidase$ 생산의 조절양식을 조사하였다. xylA 프로모터 부위를 분리하여 lac 프로모터가 없는 고복제수의 lac 오페론 백터인 pMC1403에 클로닝시켜 pMCX191을 제작하여 reading frame에 변화가 없는 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 만들었으며 이 벡터에서 Pxyl-lacZ 단편을 분리한 후 저복제수 벡터인 pLG339에 클로닝시켜 pLGX191을 제작하였다. 상기 플라스미드들을 xylA 변이주인 DH77에 형질전환시켜 Pxyl-lacZ 융합 유전자에서 ${\beta}-galactosidase$의 발현조절을 조사한 결과 xylose 농도에 따른 유도, glucose에 의한 발현억제 및 cAMP에 의한 억제해제 양상 등이 염색체상의xylA 유전자의 발현조절과 같은 경향을 나타내었다. pMCX191과 pLGX191을 이용하여 유전자 투여 량 효과를 본 결과도 복제수에 따른 차이가 크지 않았다. xylA 프로모터 부위내 조절영역를 추정하기 위해 구조유전자 상류 -209 bp를 포함한 xylA 유전자를 pUC19에 클로닝시킨 pUX30에서 프로모터 부위가 부분결손된 벡터들을 제작하여 결손부위의 염기서열을 확인하였다. 이들 부분결손 xylA 프로모터를 가진 xylA 유전자에서 xylose isomerase의 발현을 조사한 결과, 번역 개시점에서 -166 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX31과 pUX32의 경우pUX30과 비슷한 발현 양상을 보인 반면 -120 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX33과 pUX34에서는 모벡터에 비해 약 30% 수준의 발현을 보였다. 또한 pUX33과 pUX34에서는 xylose 유도시 cAMP에 의한 발현 촉진효과도 볼 수 없었다. -59 bp 이상의 부위가 결손된 pUX35의 경우에는 전혀 xylA 유전자의 발현이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 볼때 xylA 프로모터내의 조절부위는 -165 bp에서 -59 bp 사이에 존재하는 것으로 추정되었다.

• 한국산림과학회지
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• 제87권3호
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• pp.334-340
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• 1998

이 연구(硏究)는 promoter가 없는 외래(外來) 유전자(遺傳子)를 양황철의 genome에 인위적으로 삽입시킨 후 도입된 유전자(遺傳子)가 식물 프로모터의 영향으로 발현되는 현상을 이용하여 식물의 프로모터 혹은 유전자(遺傳子) 발현조절 염기서열(鹽基序列)을 분리, 구명하기 위해 수행되었다. 형질전환된 세포의 선발을 위하여 nptII 유전자(遺傳子)를 선발 표지로 사용하였고, 발현되는 유전자(遺傳子)의 검정을 위한 reporter보는 GUS 유전자(遺傳子)를 사용하였다. 형질전환 후 재분화된 3클론 중 nptII 및 GUS의 발현에 모두 양성인 개체의 DNA에서 730bp 염기서열(鹽基序列)을 inverse PCR로 증폭 분리하여 클로닝하고 이의 염기서열(鹽基序列)을 구명하였다. 이 염기서열(鹽基序列)은 Eucalyptus gunnii의 CAD(Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase) 유전자(遺傳子)와 전체적으로 약 88%의 상동성(相同性)을 보였다. 이 결과에 의하면 inverse PCR로 증폭된 부분은 포플러의 CAD 유전자(遺傳子)의 일부를 포함한 조절인자로 생각된다. 이렇게 클로닝된 DNA 염기서열(鹽基序列)과 GUS fusion된 합성 DNA를 particle bombardment 법을 이용하여 포플러 잎에 도입시킨 결과, 청색반점(靑色斑點)이 생성되는 것으로 보아, 분리된 부위가 식물체내에서 발현조절기능을 하는 일부분으로 작용하는 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제19권6호
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• pp.809-817
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• 2009

식물에서 유전자의 기능을 연구하는데 있어서 유전자가 과발현 되거나 발현이 억제되는 형질전환체는 해당 유전자의 기능과 관련되어 매우 유용한 정보를 제공한다. 본 연구에서는 modified CaMV 355, UBQ3, UBQ10 프로모터를 pPZP211 벡터에 각각 클로닝 하여 Agrobacterium을 매개로 한 과발현형질전환 식물체 제작에 유용하게 이용할 수 있는 pFGL571, pFGL846, pFGL847을 제조하였다. 이 벡터들은 크기가 작고, 박테리아 내에 high copy로 존재하며, 다중 클로닝 부위에 다양한 제한효소 부위를 가지고 있고, 전체 서열이 알려져 있는 등의 장점을 가지고 있다. GUS 또는 sGFP 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제조하여 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터의 활성을 분석한 결과, 세 프로모터 모두 발아 후 대부분의 발달단계와 성숙한 식물체의 꽃 기관에서 높은 활성을 보였다. 한편, 식물에서 유전자 발현 억제에 이용할 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727을 제조하였고, pFGL727을 이용한 벼 RNAi 형질전환체의 분석을 통해 이벡터가 유전자의 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다. 연구 결과를 종합해 보면, 본 연구에서 제조한 벡터들은 식물에서 유전자 과발현과 발현 억제에 유용하게 이용될수 있을 것으로 기대된다.

• 미생물과산업
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• 제15권2호
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• pp.24-28
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• 1989

폐염균의 특징은 폐염, 류마티스성 심장병, 수막염 등의 질병을 일으키는 병원균이라는 것과 아주 높은 효율로 형질전환을 할 수 있다는 사실이다 ($10^{8}$ 개의 균에 염색체 DNA 1.mu.g을 써서 실험하였을 때 $10^{6}$개의 transformant를 얻을 수 있음). 폐염균이 자연상태에서 이렇게 높은 효율의 형질전환을 할 수 있는 이유는 정상생리의 일부로서 형질전환에 관계된 유전자가 형질전환을 할때 발현되기 때문이다. 그러나 폐염균 형질전환에 대한 연구는 아직도 초기단계라고 할 수 있으며 그 이유는 현재 전세계적으로 극소수의 연구자들만이 연구를 수행하고 있기 때문이다. 즉, 미국 Brookhaven National Laboratory의 Lacks와 프랑스 CNRS의 Claverys는 mismatch repair에 대한 연구를, Illinois 대학의 Morrison은 competence에 대해, 미국 Rockefeller 대학의 Hotchkiss와 Tomasz는 DNA binding을 연구하고 있을 뿐이다. 본 논고에서는 폐염균 형질전환에 대해 지금까지의 연구 상태와 문제점, recP의 클로닝에 대해 소개하고자 한다.