표고버섯(Lentinula edodes) 으로부터 0.15 M NaCl 용액에 의하여 crude lectin을 추출하였으며, 황산암모늄에 의한 침전 음이온교환수지 및 hydroxyapatite 컬럼을 이용한 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 버섯균산과 균병으로 나누어 추출된 crude lectin의 양에 있어서는 균산부분이 균병부분에 비하여 2배 이상 높은 lectin을 함유하였으며, 가열한 버섯에서는 lectin의 함량 및 활성은 미처리보다 감소되었다. 건조된 균산 50 g으로부터 얻은 crude lectin은 720 mg으로서 46.03%의 수율로 얻었으며, DEAE Sephadex A-50 column에 의한 분리, 정제 후 정제된 lectin 201 mg을 crude lectin의 28% 수율로 얻을 수 있었다. Crude lectin을 정제함으로서 aspartic acid, serine, alanine 및 histidine등의 아미노산이 증가되었고, glutamic acid, glycine, leucine, tyrosine 및 methionine 등이 lectin에는 검색되지 않았다. DEAE Sephadex A-50 column의 chromatograpy를 통해 분리 정제한 활성을 지니는 lectin의 주된 부분은 Agglutinating test 결과, fraction A 및 B는 적혈구응집활성을 나타냈으며, 약 23 kDa의 분자량을 가지고 있었다. 활성을 지니는 부분을 다시 hydroxyapatite column에 의해 정제하여 얻은 LA-a와 LB-b는 각각 24 kDa과 23 kDa의 분자량을 나타냈다.
남조류 독성물질인 Microcystins은 자연계에 매우 미량 존재하기 때문에 이를 분리 및 정제하기가 쉽지 않다. 본 연구에서는 자연계에 존재하는 남조류 동결건조시료로부터 Microcystin RR과 LR을 분리 및 정제하는 새로운 방법을 개발하였다. 약 7.5g의 실리카겔을 정지상으로 사용하고 혼합용액인 ethyl acetate: iso-propanol:water(30: 45: 25)을 이동상으로 사용하는 open column system으로 시료를 전개한후 용액을 3mL간격으로 받아냈다. 받아낸 용액중의 Microcystin RR과 LR은 TLC와 HPLC(high performance Liquid Chromatography)를 이용하여 확인한 후 농축, 정제하였다.
충치 예방 물질의 탐색 연구 일환으로, Cacao bean husk(CBH) 추출물로부터 얻어진, gluco-syltransferase(Gtase) 저해 활성 분획을 분리하였 다. 이를 다시 MCI-gel CHP-20와 Sephadex LH 20의 column chromatography법으로 분리, 정제하였으며, 이로부터 얻어진 2개의 GTase 활성 저해 물질에 대한 구조 해석을 행하였다. 분리.정제된 2개의 GTase 저해 활성 물질은 anisaldehyde-$H_2SO_4$ 및 FeCb에서 각각 갈색 및 청색 반응을 하며, 또 TLC상에서 dimer의 flavan-3-ol $R_r$값을 나타내는 단일 물질이었다. NMR(PMR, C CMR) 빛 mass spectrum으로 두 정제 분획에 대 한 화학 구조를 분석한 결과, G Tase 저해능을 나타 내는 단물질은 (-)-epicatechin-($\beta\rightarrow8$)-catechin 으로 결합된 procyanidin B-1 ($C_{30}H_{26}O_{12}$) 및 cate chin의 2량체인 procyanidin B一3($C_{30}H_{26}O_{12}$)이었다.
Valencia 오렌지로부터 추출한 펙틴에스테라제(pectinesterase, PE) 중에서 가열처리하지 않은 PE 조효소를 CM-Sephadex C-50, Phenyl Sepharose CL-4B와 CM-Biogel A의 chromatography를 차례로 수행하여 내열성이 약한 TLPE(thermolabile pectinesterase)와 내열성이 강한 TSPE(thermostable pectinesterase)를 분리 정제하였다. PE 중에서 가열처리한 PE 조효소에서는 위와 같은 정제과정으로 TSPE 만을 분리하였다. TLPE는 비활성 1,005 units/mg이고 35배로 정제된 것을 13.6% 회수할 수 있었으며, 반면에 가열하지 않고 분리한 TSPE는 비활성 3,115 units/mg이고 100.5배로 정제된 것을 1.5% 얻을 수 있었으나 가열하여 분리한 TSPE는 비활성 1,803 units/mg이고 가열처리한 조효소가 140배로 정제된 것을 15.4% 얻을 수 있었다.
단백질 또는 peptide bond를 가수분해하는 protease는 현재 산업의 각 분야에서 널리 응용되고 있으며, 사용범위가 점차 확산되고 있는 추세이다. 따라서 본 실험에서는 미생물이 생산하는 단백질분해효소를 분리 정제하여 그의 성질을 규명 및 skin turn-over 효과를 조사하였다.
분리막 공정은 상변화를 일으키지 않기 때문에 장치비가 저렴하며, 열 및 화학적으로 민감한 물질, 특히 생체물질 등을 다루는데 적합하다. 또한 최종 생성물질을 정제하는 방법으로는 이온교환 크로마토그래피, 전기 영동 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 있다. 이중 친화성 크로마토그래피는 가장 선택적이고, 단일 장치로서 기존의 분리방법에 비해 약 1000배 가까이 정제할 수 있다. 본 실험에서는 트립신 억제제인 m-aminobenzamidine을 포함하고 있는 수용성 고분자를 제조하여 트립신을 선택적으로 분리하고자 하였으며, 본 연구 필요한 분리막은 막제조가 용이하며 비용이 저렴한 cellulose acetate막을 사용하였다. CA 막의 세공크기는 겔화매질의 에탄올 농도로 조절하였다. Casting 용액의 조성은 다음 표에 간략하게 나타내었다.
54% 순도의 공업용 n-헥산을 HPLC급으로 분리, 정제하였다. 분별증류법으로 분리하기 어려운 methylcyclopentane, 2-methylpentane, 그리고 3-methylpentane 등은 molecular aieve 5A를 이용한 액체-고체 크로마토그래피법으로 분리하였다. HPLC 용매로서 엄격히 규제받는 UV와 형광불순물은 알루미나와 실리카겔을 이용한 흡착법으로 정제하였다. 이와 같은 방법으로 n-헥산을 정제함으로써 수분, 색도(APHA), 산도, 증발잔류물, 황 및 thiophene 등의 불순물 항목을 모두 HPLC급의 규격까지 낮출 수 있었다.
막분리(membrane separation)법은 막 전후의 압력차, 농도차 등을 추진력(driving foroe)으로 하여 분리대상물질에 대한 막의 선택투과성 차이를 이용, 분리를 행하는 것이다. 이 분리법은 기존의 분리공정인 심냉법(cryogenic separation)과는 달리 상변환 공정이 필요없어 에너지가 적게 들고 또한 PSA(pressure swing adsorption)법에서와 같은 cycle 운전이 필요없어 연속적으로 분리가 가능하며 시스템도 간단하다. 최근 기체 막분리의 경우 수소 및 탄산가스의 회수정제, 공기중의 산소와 질소의 분리 등에 실용화되고 있다. 여기서는 공기중의 산소를 분리하여 30-40% 산소부화공기(oxygen enriched air)를 간편하게 제조할 수 있는 산소부화막장치와 연소장치에의 응용기술 및 연구결과에 대해 간략히 소개하고자 한다.
균체가 생산하는 laccase 효소가 다방면으로 이용되면서, 이 효소를 균체로부터 대량으로 생산하고 분리.정제하여야 할 필요성이 대두되고 있다. 아울러 이 효소의 활성을 유도하기 위한 inducer 로서 2,5-xylidine 이 주로 사용되고 있는바, 이 xylidine 의 유독성이 인정되면서 사람에게 독성을 주지 않는 환경친화적 inducer의 검색이 필요하게 되었다. 본 연구에서는 백색부후균 Cerrena unicolor가 분비하는 laccase 효소의 유도를 위한 inducer로서 ferulic acid를 사용하였으며, 균체로부터 생산 및 분리된 laccase 효소의 정제특성을 구명코자 하였다. 본효소(constitutive enzyme)로서 I 및 II를, ferulic acid를 inducer로 사용한 경우 inducing 효소 III을 분리.정제하였다. 본 효소 I 및 II의 Michaelis 정수는 각각 737 M, 716 M 이었고, inducing효소 III은 167 M 로서, 기질에 대한 높은 친화성을 보여주고 있다. 분자량도 각각 65 kD, 63 kD 였으며, inducing효소 III은 59 kD 였다. 두효소 모두 15-19%의 당 및 단백질분자당 4M의 동(Cu)을 함유하고 있었다. 정제효율은 효소 I 및 II가 10.1%, 9.4% 였으며, III은 3.2% 였다. 모든 효소의 최적 pH 는 5.5였으며, 최적온도는 비교적 높은 $40^{\circ}C$였다.
무우 속의 매운 맛 성분을 용매추출법 ($CCl_4$,사용)으로 분리하여 RP-HPLC법에 의해 정제한 후에 관능검사에 의해 pungency test를 하고, UV spectrum분석, GC/MC 분석을 수행한 결과 4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate 임을 확인하였다. RP-HPLC에서 mobile Phase로 70% acetonitrile을 사용하였는데, 정제된 4-methylthio-3-butenyl isothiocfanate는 단일 peak로 분리되어 나왔고 이때의 retention time은 5.2분이였다. 아울러 RP-TLC에서 Rf치는 0.9이었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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