동맥경화증은 동맥 내피세포의 손상으로 인해 내막층에 지질이 축적되어 발생 되는 염증성 질환으로 동맥 내막에 침윤되는 백혈구와 백혈구에서 분비되는 전염증성 싸이토카인에 의해 죽종형성이 시작된다. 꾸지뽕은 뽕나무과의 작은 나무로 그 추출물은 항염증, 항산화, 항암의 효과를 가지고 있다. 그러나, 동맥경화증에서 효능은 명확하게 연구되지 않았다. 본 연구에서는 동맥경화증의 초기 진행에서 꾸지뽕의 항염증 효과를 알아보고자 꾸지뽕 뿌리의 추출물을 수득하였고, 동맥경화증의 동물 모델인 ApoE 결손 생쥐에서 복강대식세포를 분리하였다. 분리된 복강대식세포에 LPS로 염증반응을 유발하고 꾸지뽕 뿌리 추출물을 처리하였을 때 100㎍/ml 이하의 농도에서 세포 생존율의 변화가 관찰되지 않아 이 농도를 추가 실험을 위한 유효 농도로 설정하였다. 또한, LPS에 의해 증가한 염증 싸이토카인(MCP-1, IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-6)의 발현이 꾸지뽕 뿌리 추출물에 의해 감소하였다. 따라서, 꾸지뽕 뿌리 추출물은 동맥경화의 잠재적 위험성을 가지고 있는 대식세포에서 항염증 효과를 나타내어 동맥경화증의 치료제 개발에 이용 가능할 것이다.
초석잠의 항암효과 및 면역조절자로서의 기능을 알아보기 위하여 마우스를 이동하여 실험한 결과, 마우스 비장세포의 증식반응은 항진시켰으나 YAC-1 세포주의 증식능은 억제시켰다. CD4+ T세포 및 CD8+ T세포의 비율이 정상 대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD4+/CD8+ 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF-$\alpha$ 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 초석잠의 항암제 및 면역반응 조절자로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다.
밀 배아에서 제조된 arabinoxylan(A1: low MW, A2: medium MW, A3, high MW)의 면역세포 활성화 작용을 invitro에서 마우스 비장 림프구와 복강 대식세포를 대상으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 밀 arabinoxylan으로 처리된 마우스 비장 림프구의 생존능을 살펴보았을 때 50, $100\;{\mu}g/mL$ 농도에서 A3이 비장 림프구의 생존을 증가시켰고 비장 림프구에 $10\;{\mu}g/mL$ LPS를 첨가하여 활성화된 상태에서 $20\;{\mu}g/mL$ arabinoxylan을 처리한 결과 A1과 A3이 대조군에 비해 비장 림프구의 생존을 유의적으로 증가시켰다(p<0.05). 마우스 복강 대식세포의 생존율 관찰한 결과 $10{\sim}100\;{\mu}g/mL$ 농도에서 A1과 A3은 대식세포의 생존을 유의적으로 증가시켰다(p<0.05). 대식세포의 암세포 살해능을 살펴보았을 때 $5\;{\mu}g/mL$ 농도의 A3이 암세포독성을 유의적으로 증가시켰으며, phagocytic index를 측정한 결과 arabinoxylan을 $20\;{\mu}g/mL$ 농도로 처리했을 때, 대조군에 비하여 유의적인 증가 효과를 나타내어 밀 arabinoxylan이 대식세포의 식세포 작용을 증가시킴을 알 수 있었다(p<0.05). 또한 arabinoxylan은 대식세포의 lysosomal phosphatase와 myeloperoxidase 활성을 유의적으로 증가시켰으며(p<0.05) NO 생성을 감소시키는 경향을 나타내었다. 대식세포에서 분비되는 $H_2O_2$의 양을 측정한 결과, arabinoxylan은 유의적인 $H_2O_2$ 생성 증가를 나타내었고(p<0.05), NBT 환원법으로 대식세포의 $O_2$ 생성 지표를 측정하였을 때, arabinoxylan은 유의적으로 대식세포의 NBT 환원을 증가시켰다(p<0.05). 이상의 결과로 미루어 볼 때, 밀 arabinoxylan의 면역세포 활성화 효과는 대식세포에서 분비되는 lysosomal enzyme 및 반응성산소종(ROI)의 생성과 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다.
본 연구는 동충하초(Cordyces militaris) 유래의 기능성 물질인 코디세핀의 면역활성을 검증하기 위하여 C57BL6 마우스 복강 대식세포를 이용하여 코디세핀이 대식세포의 활성화에 미치는 영향에 대하여 시험하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 마우스 복강세포는 코디세핀의 작용에 의해 IL-$1{\beta}$, IL-12, TNF-${\alpha}$의 염증성 사이토카인의 생성이 증대되어 초기 염증매개 반응을 유도하여 선천면역반응의 활성화와 그리고 면역작용에 있어 후기 적응면역의 전환으로의 T 림프구의 활성화가 예상된다. 또한 IL-6의 생성증대로 활성화된 T 림프구에 의해 B 림프구의 항체생성반응을 매개하는 면역반응도 상승할 것으로 사료된다. 그리고 대식세포에 의한 염증반응에서 염증매개인자인 NO와 $H_2O_2$의 생성을 증대시킴에 따라 대식세포의 독성작용을 활성화시켜 염증반응을 효과적으로 유도할 것으로 보이며, 또한 $H_2O_2$의 후기 생성을 저해하였는데 이는 염증반응에 유도될 수 있는 세포의 손상으로부터 세포를 보호할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 코디세핀은 외부인자로부터 염증매개성 면역반응의 증강작용을 나타내는 것으로 사료된다.
본 연구는 5주간의 고지방 식이(45% 지방)가 복강 대식세포의 면역 반응에 미치는 효과를 분석하였다. C57BL/6 마우스(4주령, N=16)를 2집단으로 나누어 고지방 식이집단(HD, N=8)은 45% 지방 함량 고지방식이를 정상 식이집단(ND, N=8)은 정상식이(10% 지방)를 5주간 실시하였다. 복강 대식세포는 복강세척법을 이용하여 획득하였으며, LPS (lipopolysaccharide, $1{\mu}g/ml$, 24시간)를 이용하여 배양하였다. 체중은 고지방식이 후 유의하게 증가하였으며, LPS 처치 후 HD그룹의 산화질소, IL-$1{\beta}$ 및 IFN-${\gamma}$ 생성량은 ND그룹에 비하여 유의하게 낮았다. 그러나 두 집단에서 TNF-${\alpha}$와 IL-12의 생성량은 유의한 변화가 없었다. 이러한 결과는 비만 시 대식세포의 식균작용, 산화질소, IL-$1{\beta}$ 및 IFN-${\gamma}$ 생성량이 낮아짐에 따라 면역반응과 항원자극 감수성이 저하되는 것으로 사료된다.
본 연구는 우리나라 야산에서 손쉽게 구할 수 있는 구황식물인 어성초를 이용하여, 시험관 내 실험 및 생체 내 실험을 실시하여 어성초의 면역증강제로서 가능성을 살펴보았다. 시험관 내 실험에서는 건조시켜 분쇄한 어성초를 메탄올로 추출한 후 극성에 따라 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통추출하여 비장세포 증식능과 복강대식세포에 의한 사이토카인 분비능을 측정하였다. 그 결과, 비교적 극성이 높은 부탄을 분획물과 물 분획 물 첨가시에 비장세포 증식능이 250 $\mu\textrm{g}$/mL의 농도군에서까지 향상됨을 볼 수 있었다. IL-1$\beta$와 TNF- $\alpha$는 클로로포름과 물 추출물을 첨가했을 때 대조군에 비해 유의적으로 많은 양이 분비되었고, IL-6 는 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층에서 대조군에 비해 유의적으로 향상되었다. 이들 세가지 사이토카인의 분비 수준은 모두 B 림프구를 자극하는 미토젠인 LPS보다는 높았으므로, B 림프구 자극 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 시험관 내 실험의 결과를 토대로 하여 2주간 격일로 어성초 열수 추출물을 마우스에게 직접 경구 투여하고 비장세포 증식능과 활성화된 복강 대식세포에 의한 염증성 사이토카인(IL-l$\beta$, IL-6, TNF- $\alpha$)의 분비량을 측정하였다. 그 결과 비장세포 증식능은 ConA와 LPS로 처리시 어서초 추출물을 500 mg/kg bw 농도로 투여 한 군에서 각각 최대의 비장세포 증식을 보였다. 활성화된 복강 대식 세포에 의한 사이토카인 분비량을 측정한 결과 500 mg/kg bw와 1000 mghg bw의 농도로 투여시 대조군에 비해 유의적으로 많은 양의 IL-6를 분비하였고, 500 mg/kg bw 투여군에서 대조군에 비해 많은 양의 TNF-$\alpha$를 분비하였다. 그러나, IL-1$\beta$의 분비량은 대조군에 비해 오히려 급격히 감소하는 것으로 나타나 어성초의 투여가 IL-$\beta$ 분비를 자극하지는 못하는 것으로 나타났다. 따라서 어성초 열수 추출물을 생체내에 적용시켰을 때 비장세포의 증식을 유도하고 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6와 TNF- $\alpha$의 분비를 촉진시키는 효과가 있는 것으로 나타났으며 , 적정 양은 500 mg/kg bw 정도인 것으로 사료된다. 비장세포 증식능과 복강 대식 세포 활성화를 통한 연구 결과에 의하면 어성초는 비교적 극성이 높은 용매에 용해되는 부분에 면역증강효과가 있는 물질이 함유되어 있는 것으로 판단된다. 따라서, 앞으로는 그 성분에 대한 순수 분리 및 이를 동정하는 연구가 계속적으로 이루어져야 할 것으로 보이고, 이는 식품소재개발에 있어서 중요한 기초 자료가 될 것으로 보인다.
목적 : 방사선조사가 세포내재성 병원균인 Listeria monocytogenes (LM)의 감염에 미치는 영향과 함께 감염면역과 밀접한 관계가 있는 대식세포에서의 $TNF-\alpha$ 및 Nitric oxide (NO) 생산능의 변화와 비장세포에서의 $IFN-\gamma$ 및 IL-2생산능에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 시행하였다. 대상 및 방법 : 실험동물로는 BALB/c 마우스를 사용하였으며 Co-60 원격치료기를 이용하여 방사선을 조사하였다. LM감염에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 방사선조사 1일후 $10^5$의 LM균을 복강내에 주사하고 1일, 3일, 5일후에 비장조직에서 LM생균수를 측정하였다. 방사선조사가 마우스의 생체내에서와 시험관내에서의 $TNF-\alpha$의 생산능에 미치는 효과를 관찰하기 위해서 각각 LPS로 유도하여 L929/Actinomycin D assay에 의해 $TNF-\alpha$량을 측정하였다. $IFN-\gamma$의 생성능은 방사선조사후 비장을 적출하여 비장세포액을 제조하여 Concavalin A (Con-A)로 자극한 후 정량검사를 하였다. IL-2의 생성능은 $IFN-\gamma$실험에서와 같이 비장세포를 얻어서 Con-A로 자극하여 CTLL-2세포의 성장촉진능력을 관찰함으로써 판정하였다. 방사선조사가 복강내 대식세포에서 생산되는 NO에 미치는 영향도 관찰하였다. 결과 : 방사선 (300cGy)을 조사한 군에 LM을 감염시킨 1일후 비장으로부터 검출되는 생균수는 대조군에 비해 감소하였으나 감염 3일 5일후의 생균수는 대조군에 비하여 오히려 증가하였다. 시험관내 복강대식세포에 방사선 (100-850cGy)을 조사하면 1일후 생산되는 $TNF-\alpha$의 양은 대조군에 비하여 증가하였으나, 방사선조사 (100-600cGy) 5일후 수집된 복강대식세포에 의한 $TNF-\alpha$의 생산은 오히려 감소하였고. 방사선조사 (300cGy)후 LM감염시 5일후 유도된 생체내 $TNF-\alpha$의 생산도 대조군에 비해 감소하였다. 방사선 (300cGy)을 조사한 마우스로부터 적출한 비장세포로부터 생산되는 $IFN-\gamma$와 IL-2의 양은 대조군에 비해 감소하였다. NO의 양은 100cGy 및 300cGy조사시 대조군에 비해 증가하였으며 그 이상 조사량을 증가하면 점차 감소하였다. 결론 : 방사선조사후 세포내재성 병원균인 LM감염에 대한 초기 저항성의 증가와 감염중반이후의 저항성 감소는 대식세포에서의 초기 $TNF-\alpha$ 생산능 증가후 감소, 그리고 T림프구에서의 $IFN-\gamma$및 IL-2 생산능 감소와 관련이 있을 것으로 사료된다.
기생충감영시 cytokine으로 활성화된 대식세포가 방어기전의 Effector cell로 작용할 때 분비하는 nitric oxide의 양 및 TNF-$\alpha$ 와 IFN-$\gamma$의 분비정도와 nitric oxide와의 상관관계 등을 알아보기 위하여 3종의 흡충류, Fasciola, paragonimus, Schistosma의 조항원 (100mg/ml)을 마우스 복강내에 주사 후 24시간, 72시간, 9일간격으로 마우스의 대식세포(1X10$^{6}$/ml)를 분리하여 RPMI 배지 (10% FCS 첨가)에서 48시간 배양후 Nitric TNF-$\alpha$ 및 IFN-$\gamma$를 ELISA로 정량하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Nitrite 생성정도는 Fasciola 조항원으로 24시간 감작시킨 대식세포에서 가장 높게 나타났으며 (140$\mu$M/ml) Paragonimus 항원군에서는 24시간에 최고치에 달하였다가(34 $\mu$M/ml) 시간이 경과함에 따라 점차 감소하였다. IFN-$\gamma$는 Paragonimus 항원군에서만 대조군에 비해 높았으며 9일경에 최고치를 보였다(475ng/ml). TNF-$\alpha$는 Schistosoma 항원군에서는 nitric oxide의 생성과 분비 양상이 일치하였다. 위의 결과에 의하면, 흡충류항원으로 감작된 마우스 대식세포의 nitric oxide 생성에 영향을 미치는 cytokine의 종류는 흥충류에 따라 차이를 보였으며, 이 중 Paragonimus 항원에 의해서는 IFN-$\gamma$의 분비가 촉진되는 것으로 나타났고, Schistosoma 의 경우에는 TNF-$\alpha$가 nitric oxide의 생성에 관계함을 알 수 있었다.
본 실험은 대식세포 화학주성과 세포내 칼슘과 F-actin 증가에 대한 인삼사포닌 분획의 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 여러 가지 인삼사포닌 분획을 처리한 복강 대식세포는 대조군에 비해 화학주성이 28.4-71% 증가하였다. 세포내에 유리된 칼슘의 양은 65%까지 증가하였으며, NBD- phallacidin을 처리한 세포에서 F-actin의 양은 10% 증가하였다. 칼슘이나 PMA로 활성화시키고 사포닌 분획을 처리하였을 때, F-actin의 양은 현저하게 증가하였으며 이러한 현상은 2분까지 지속되었다. 이러한 결과로 보아 인삼사포닌 분획이 chemoattractant로 작용할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서는 전통적인 기능성 식품이자 의약품으로 사용되었던 자죽염(PubS)과 복분자를 조합한 복분자 자죽염(PuBS-R)을 사용해 비특이적, 선천성 면역에 중요한 역할을 하는 대식세포에서의 영향을 확인하였다. PuBS-R은 마우스 대식세포인 Raw264.7 세포에서 $1,000{\mu}g/mL$ 농도처리 시 세포의 증식을 유발하였으며, 그에 반해 PuBS를 $1,000{\mu}g/mL$ 처리 시 유의하게 세포 증식률이 억제되었다. 이어서 면역 관련 사이토카인 $TNF-{\alpha}$, $IFN-{\gamma}$, IL-12, IL-10 등을 유전자 단계와 단백질 단계에서 평가하였다. 그 결과 PuBS-R은 50, 100, $500{\mu}g/mL$에서 유의한 증가율을 보였고, 무엇보다 이것은 PuBS 군에 비해서도 월등한 증가율을 확인할 수 있었다. 마지막으로 마우스의 복강에서 분리한 peritoneal macrophage에 PuBS-R을 처리 후 $TNF-{\alpha}$, $IFN-{\gamma}$, IL-12, IL-10, iNOs를 단백질 단계에서 평가한 결과, Raw264.7 세포에서 얻은 결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아 PuBS-R은 인체의 대식세포 활성의 증가를 통해 비특이적, 선천성 면역력을 증가시킬 것으로 판단되며, 이러한 결과를 바탕으로 추후 실험동물을 이용한 in vivo 후속 연구를 통해 PuBS-R의 면역증강 기능성 식품 개발이 가능할 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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