• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.63-63
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• 2001

본 실험은 소에서 체외수정란과 복제수정란을 modified CRlaa (mCRlaa) medium에서 각각 배양하였을 때 배반포단계까지 발육율을 비교하였다. 체외성숙은 TCM-199 medium에 10 %의 Fetal Bovine Serum (FBS)를 첨가한 배양액에서 실시하였고 이를 이용해 체외수정과 복제를 시행하였다. 체외성숙란과 복제수정란의 배반포까지 발육율은 각각 22.5 %, 19.4 %이었다. 복제수정란을 생산하기 위해서는 제핵을 실시한 난자내로 공여핵를 도입하는 과정이 필요한 데 할구보다 체세포를 이용하는 경우 융합율이 저하되는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 공여핵을 제공하는 체세포와 수핵란간에 융합을 기존에 많이 사용한 chamber와 비교해 Needle을 사용했을 때 복제수정란의 발육율간의 차이를 서로 비교하였다. Ear skin cell을 이용해 핵이식을 실시한 다음 Zimmerman cell fusion medium에서 융합하였다 융합된 핵이식란은 5 % $CO_2$, 5 % $O_2$, 90 % Na, 38.5$^{\circ}C$ 조건에서 배반포까지 배양하였다. Chamber와 Needle을 사용한 경우 융합율은 각각 46.1 %, 70.4 %, 분할율은 62.6 %, 76.4 %로 Needle의 경우가 유의적으로 높았다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.72-72
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• 2003

대부분의 동물에서 체내 또는 체외수정란의 체외 배양 시 일정한 발육 단계까지 발달한 후 발육지연이나 정지가 되는 체외 발육억제 현상이 나타나게 된다. 특히 돼지에서는 타 가축들과는 달리 4 세포기에서 체외 발육억제 현상이 일어나기 때문에 체외에서의 발육율이 매우 낮아 수정란 생산이 제한되고 있다. 따라서 본 연구는 이러한 돼지 체외발육 억제 현상을 극복하고 돼지 체외 수정란의 체외배양 체계의 기초 자료를 얻고자 돼지 미성숙 난자를 체외에서 성숙, 수정시킨 뒤, 체외 수정란의 배양 시 성장인자와 6탄당의 첨가에 따른 체외 발육율을 검토하였다. 난자의 핵 성숙과 세포질 성숙 및 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 성장인자로는 Insulin-like growth factor-I(IGF-I)과 Epidermal growth factor(EGF)를 사용하였고, 여러 종의 번식기관에 존재하여 배반포 형성을 촉진시키는 것으로 알려진 glucose, mannose, galactose 및 fructose가 6탄당으로 사용되었다. 체외수정란의 발육을 위한 기본 배양액인 NCSU-23에 각각 0, 1, 5, 10 및 20ng/ml의 IGF-I과 EGF를 각각 첨가하여 농도의 차이에 따른 발육율을 검토하였다. 또한 5.56mM의 glucose, mannose, galactose 및 fructose에 5ng/ml의 IGF-I 또는 10ng/ml의 EGF 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 마지막으로, 각각의 6탄당에 위와 같은 농도의 IGF-I와 EGF 공동 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 그 결과 돼지 체외 수정란의 체외 발육 시 배양액 내에 서로 다른 농도의 IGF-I과 EGF를 첨가하였을 때 IGF-I은 5ng/ml(12%)에서, EGF는 10ng/ml(10%)의 실험구에서 가장 높은 배반포기 배의 발육율을 나타냈다. 또한 각각의 6탄당과 IGF-I 또는 EGF 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 IGF-I과 EGF 모두 glucose 첨가 시 타 첨가구에 비해 초기 발육 단계의 수정란 발육뿐만 아니라 배반포까지의 배발육(10～11%)이 타 첨가구(3～8%)에 비해 높게 나타났다. 한편, 각각의 6탄당이 첨가된 배양액 내에 IGF-I파 EGF 공동첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 모든 실험구에서 EGF와 IGF-I 첨가 시 무첨가보다 높은 초기 배 발육율을 나타냈으며 특히 초기 분열단계 수정란에서는 발육의 차이가 크게 나타났다. 본 연구 결과 성장인자와 6탄당의 첨가는 돼지 수정란의 체외배양 시 초기배 배발육에 효과적인 영향을 미치는 것으로 사료되며, 이는 체외 발육율이 타 가축에 비해 낮은 돼지의 수정란 생산에 있어 체외배양체계의 개선을 위한 기초자료가 될 수 있을 것이라 기대된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.64-64
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• 2003

본 연구는 돼지의 미성숙란을 체외에서 성숙, 수정시킨 후 생산된 체외수정란을 NCSU23 체외배양액에 sodium pyruvate, hemicalcium lactate 및 glucose를 첨가해 돼지 체외수정란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. NCSU23 체외배양액에 Glucose 0 mM, 2.78 mM, 5.56 mM 및 11.12 mM을 처리하여 체외배양한 결과 분할율은 glucose처리구가 무처리구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 성적을 나타냈으며(P<0.05), 상실배까지 체외발육률 또한 glucose처리구가 무처리구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 성적을 나타냈다 (P<0.05). 한편 배반포까지의 체외발육율은 5.56 mM 처리구가 다른 처리구에 비해 높은 경향을 나타냈지만 통계적 유의성은 인정되지 않았다. Glucose와 0.4mM sodium pyruvate, 2mM hemicalcium lactate 공동배양 처리구와 glucose를 첨가하지 않은 처리구의 분할율은 처리구간 커다란 차이를 나타내지 않았으며, 상실배기 이상 발육된 체외 발육율도 처리구간 커다란 차이를 나타내지 않았다. 또한, 각 처리구간 분할율은 hemicalcium lactate와 glucose공동배양 처리구가 가장 좋은 성적을 나타냈지만 통계적 유의성은 인정되지 않았으며, 상실배기 이상 발육된 체외 발육율은 hemicalcium lactate만 첨가한 처리구가 가장 좋은 성적을 나타냈지만 통계적 유의성은 인정되지 않았다. Sodium pyruvate를 체외수정 후 8시간, 48시간, 96시간, 120시간에 제거하였을 때 분할율은 sodium pyruvate를 제거하는 시기가 늦어질수록 분할율이 향상되는 경향을 나타냈지만 통계적 유의성은 인정되지 않았다. 또한, 상실배기 이상 발육된 체외 발육율은 제거하는 시기가 늦어질수록 체외 발육율이 향상되는 경향을 나타냈지만 통계적 유의성은 인정되지 않았다. 본 연구의 결과 돼지 체외수정란의 체외배양시 glucose의 첨가는 체외발육을 증진시키는 결과가 있었으며, glucose와 sodium pyruvate, hemicalcium lactate 공동배양은 체외배양에 별다른 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권3호
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• pp.249-258
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• 2003

본 연구는 돼지 미성숙 난자를 체외에서 성숙, 수정시킨 뒤, 체외 수정란의 배양 시 성장인자와 6탄당의 첨가에 따른 체외 발육율을 검토하였다. 체외수정란의 발육을 위한 기본 배양액인 NCSU-23에 각각 0, 1, 5, 10 및 20ng/ml의 IGF-I과 EGF를 각각 첨가하여 농도의 차이에 따른 발육율을 검토하였다. 또한 5.56mM의 glucose, mannose, galactose 및 fructose에 5ng/ml의 IGF-I 또는 10ng/ml의 EGF 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 마지막으로, 각각의 6탄당에 위와 같은 농도의 IGF-I와 ECF 공동 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 그 결과, 돼지 체외 수정란의 체외 발육 시 배양액 내에 서로 다른 농도의 IGF-I과 EGF를 첨가하였을 때 IGF-I은 5ng/ml(12%)에서, EGF는 10ng/m1(10%)의 실험구에서 가장 높은 배반포기 배의 발육율을 나타냈다. (p<0.05) 또한 각각의 6탄당과 IGF-I 또는 EGF 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 IGF-I과 ECF모두 glucose 첨가시 타 첨가구에 비해 초기 발육 단계의 수정란 발육뿐만 아니라 배반포까지의 배발육(10∼11%)이 타 첨가구(3∼8%)에 비해 높게 나타났다. (p<0.05) 한편, 각각의 6탄당이 첨가된 배양액 내에 ICF-I과 EGF 공동첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 모든 실험구에서 EGF와 IGF-I 첨가 시 무첨가보다 높은 초기배 발육율을 나타냈으며 특히 초기 분열단계 수정란에서는 발육의 차이가 크게 나타났다. 본 연구 결과 성장인자와 6탄당의 첨가는 돼지 수정란의 체외배양 시 초기배 배발육에 효과적인 영향을 미치는 것으로 사료되며, 이는 체외 발육율이 타 가축에 비해 낮은 돼지의 수정란 생산에 있어 체외배양체계의 개선을 위한 기초자료가 될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제12권2호
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• pp.127-132
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• 1997

본 연구는 rat에서 PMSG도는 FSH 처리에 의한 과배란 유도가 배란율과 수정란의 질에 미치는 영향을 알아보기 위해 호르몬 처리하고 교미시킨 후 4일령에 난관과 자궁을 세척하여 정상 8-세포기 난자와 비정상 난자를 조사하였고 각 처리에서 채란된 난자 중에 정상난자를 골라 체외 배양하여 발육율을 비교 평가하였다. 미성숙 rat에서는 평균19.1개의 수정란이 채취되었으며 성숙rat에서는 14.2개가 채취되었고 미성숙 rat에서는 성숙 rat에 비해 더 많은 비율의 비정상적인 난자가 회수되었다. FSH와 LH-RH에 의한 방법이 PMSG와 HCG에 의한 방법보다 유의성 있게 많은 난자를 배란시켰으며, 비정상란의 빈도도 낮은 것으로 나타났다. 그러나 호르몬 처리에 의한 두 가지 방법은 자연배란에 의한 방법에 비해 훨씬 높은 비정상난자의 배란을 유도하였다(FSH, 20.1%;PMSG, 41.2%;자연배란 13.4%). 또한 FSH처리에 의해 회수된 난자보다 체외 발육율이 높은 것으로 나타났다. 그러므로 rat에서 PMSG와 FSH를 이용하여 과배란을 유도할 수 있으나 배란된 난자의 비정상율은 자연배란에 비해 훨씬 높았고, 과배란 유도시 호르몬의 종류에 따라 체외 배양율에도 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.87-87
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• 2001

도살장에서 구입한 소의 난소로부터 회수한 미성숙 난포란을 체외에서 성숙, 수정시킨 후, 2~8세포기 수정란을 CR$_1$aa 체외배양액에 일정량의 aesculetin, taurine을 첨가하여 체외배양을 실시한 두 처리구간의 항산화 효과를 비교 검토하고, aesculetin과 taurine에 growth factor(EGF, PDGF)를 첨가배양하여 체외수정란의 체외발육에 항산화제와 growth factor의 상호작용 효과를 검토하였다. 대조구, aesculetin(1$\mu\textrm{g}$/$m\ell$) 및 taurine(2.5mM)을 첨가하여 체외수정란을 체외배양시킨 결과 상실배이상 발육된 체외발육율은 각각 46.5%, 64.3% 및 60.5%로서 대조구보다 aesculetin과 taurine 첨가구가 유의하에 높은 성적을 얻어, aesculetin과 taurine이 체외수정란의 체외발육에 높은 효과를 나타냈다. 대조구, aesculetin (1$\mu\textrm{g}$/$m\ell$) ＋ PDGF (1ng/$m\ell$) 첨가구, aesculetin (l$\mu\textrm{g}$/$m\ell$) ＋ EGF (10ng/$m\ell$)첨가구, taurine (2.5mM) ＋PDGF (1ng/$m\ell$) 첨가구 및 taurine (2.5mM)＋EGF (10ng/$m\ell$) 첨가구에서 배반포기 발육율은 각각 46.0%, 70.0%, 58.0%, 56.0 및 66.0%로써 처리구가 무첨가구에 비해 유의하게 높은 성적을 얻어(P<0.05), 항산화제와 growth factor의 첨가 배양이 체외수정란의 체외발육에 상승효과가 있음이 입증되었다. 배양액에 천연추출 aesculetin과 상품화된 aesculetin을 첨가하여 체외배양을 실시한 결과 배반포기 발육율은 대조구, 천연추출 aesculetin 및 상품화된 aesculetin 첨가구에서 각각 38.6%, 54.6% 및 53.5%로써 첨가구가 무첨가구보다 높은 성적을 얻어, aesculetin의 항산화 효과가 입증되었다(P<0.05). 그러나 모든 처리구에서 배반포까지 발육된 체외수정란의 세포수에는 커다란 차이가 인정되지 않았다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.83-87
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• 2004

본 연구는 돼지의 난포란을 체외에서 성숙, 수정시킨 체외수정란의 체외배양 체계를 확립하고 그 기작을 규명하기 위하여 체외배양액에 항산화제인 melatonin의 첨가 및 melatonin과 sodium nitroprusside(SNP)의 첨가배양이 체외수정란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하고자 실시하였다. NCSU 23 배양액에 melatonin을 0, 1, 5 및 10nM을 첨가하여 체외배양을 실시한 결과, 배반포기까지 발육율은 17.8%, 26.1%, 20.0% 및 16.3%로서 melatonin 1nM 첨가구가 여타구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 성적을 나타냈으며(P<0.05), 상실배기 이상 발육 성적에서도 melatonin 1 nM 첨가구가 39.1%로서 대조구 33.3%, 5 nM 첨가구의 33.3% 및 10 nM 첨가구의 27.9%보다 높은 발육율을 나타냈다(P<0.05). NCSU 23 배양액에 SNP를 0, 50 및 100 $\muM을 첨가하여 체외 배양한 결과, 상실배 이상 발육성적은 각각 41.9%, 25.6% 및 28.4%로서 SNP 첨가구가 대조구보다 유의적으로 낮은 성적을 나타내었다(P<0.05). NCSU 23 배양액에 대조구, SNP 50 $\muM, SNP 50 $\muM에 melatonin 1, 5 및 10nM을 혼합첨가하여 체외 발육율을 조사한 결과, 배반포기 발육율은 각각 2.5%, 1.2%, 9.9%, 5.1% 및 3.7%로서 SNP 50$\mu$M + Mel. 1nM 첨가구가 여타구 보다 높은 성적을 나타냈으며, 상실배기 이상 체외 발육율은 31.3%, 34.1%, 39.5%, 29.4% 및 39.5%로서 SNP 50 $\mu M + Mel. 1 nM 첨가구와 SNP 50 $\muM + Mel. 10 nM 첨가구가 여타구보다 높은 발육율을 나타냈다. 모든 처리구에서 배반포까지 발육된 체외수정란의 세포수는 커다란 차이가 인정되지 않았다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제12권3호
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• pp.253-258
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• 1997

토끼에서는 수정란 이식과 같은 기본적인 번식공학적 방법의 효율성이 아직 생쥐와 같은 실험동물에 비해 떨어지고 있어 생물공학적인 기술을 응용하는데 큰 어려움이 있다. 특히 유전자 이식에 의한 형질전환 토끼의 생산과 같은 생물공학적인 기술을 실용화하는데 효율이 높은 수정란이식 기술의 개발이 필수적이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 토끼에서 수정란 이식 기술의 첫 단계인 과배란 유도를 효율적으로 이용할 수 있는 방법을 정립하기 위해 반복적인 과배란 유도가 배란율 및 수정란의 질적인 면과 양적인 면에 미치는 영향을 조사하였다. 연구방법으로는 FSH와 HCG를 사용하여 과배란을 유도하였고 2.5 개월의 반복처리간격으로 3번의 반복적인 과배란 처리를 한 후 반복처리에 따른 배란율과 배란된 난자의 형태학적 상태, 배양에 의한 발생 능력 상태 등을 감소하였으며 배란수의 변이도 커지는 경향을 나타내었다(첫번째, 32.6(+-)2.5; 두번째 28.7(+-)3.7; 세번째 20.99(+-)3.8). 제 2극체의 돌출, 전핵의 형성, cummulus cell의 존재등에 의한 회수된 난자의 형태학적 관찰에 의한 방법으로 난자를 분류한 결과 과배란의 반복수가 증가함에 따라 다양한 모양의 난자가 회수되어 배란이 광범위한 시간대에 일어나고 있음을 나타내었다. 또한 과배란의 반복적인 유도에 의해 난소의 혈포수는 증가하였으나 채란된 난자의 채외배양에 의한 발육율에는 차이가 없었다. 그러므로 과배란의 반복적인 유도는 공란토의 난소반응에는 영향을 미쳤으나 난자의 질에는 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권3호
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• pp.175-180
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• 2006

본 연구는 융합 전 수핵란의 활성화 처리 유무와 활성화 처리 시간이 소 체세포유래 핵이식란의 체외 발육능에 미치는 영향을 검토하기 위해 수행하였다. 소 체외성숙란의 탈핵 후 체세포 핵을 이식하고 일부는 전기 융합 후 활성화를 유기하였고(pre-AC), 일부는 먼저 활성화 처리 후 융합을 실시(post-AC)하였다. 난자의 활성화는 $Ca^{2+}$-ionophore(A23187)로 처리 후 DMAP로 4시간 배양하는 방법으로 유기하였다. 핵이식란은 CR1aa액에서 9일간 배양하여 발육율을 검토하였으며, 활성화 후 30분${\sim}$2.5시간에 고정하여 confocal microscope하에서 핵형 변화를 검사하였다. 배반포기까지 발육율은 post-AC구(20.6%)가 pre-AC(15.3%)보다 다소 높게 나타났다. 또한 활성화 처리를 하여 핵이식란의 배 발달을 비교한 결과 post-AC구가 더 늦은 배 발달 속도를 나타내었다. Post-AC구를 활성화 후 30분, 2시간, 4시간으로 나누어 융합하여 발육율을 검토한 결과 발육율에 차이가 없었다. 본 연구의 결과는 수핵란의 활성화 시간에 따라 핵이식란의 발육 및 핵형이 영향을 받을 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.33-39
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• 2002

소 체세포 핵이식 시 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 융합율, 핵형의 변화, 배 발달율을 검토한 결과는 다음과 같다. 1. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도를 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM로 각기 다르게 처리한 결과, 0.5와 1.0 mM의 CaC$_2$에서 융합율이 80.5 와 84.3%로 나타나 0.05 mM CaCL$_2$에서의 융합율 56.6%에 비하여 유의적(P＜0.01)으로 높았다. 2. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 재구축배의 핵형을 검토한 결과, CaCL$_2$농도 0.05와 0.1 mM 에서는 88.4와 84.0%의 난자가 PCC이후 염색질괴를 형성한 반면, 0.5와 1.0 mM 에서는 54.5와 59.3%가 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하여, $Ca^{2+}$ 농도가 증가함에 따라 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하는 난자의 비율이 증가하였다. 3. 핵이식란의 체외 발육율을 검토한 결과, 1.0 mM CaCl$_2$에서는 배반포 발육율이 30.6%로 나타난 반면, 0.1 mM CaCl$_2$에서 는 20.0%로 나타나 유의적(P＜0.05)인 차이를 나타냈다. 본 연구의 결과는 융합액 내 $Ca^{2+}$농도의 증가가 소 체세포 핵이식란의 융합율 및 배반포 발육율을 향상시킬 수 있음을 시사한다.