본 연구는 인간면역결핍바이러스의 입자를 비이온성 계면활성제로 처리할 때 바이러스 입자구조에서 분리되어 방출되는 바이러스 구조단백질들의 분포를 sucrose gradient로 분석하여, 바이러스 입자를 구성하는 바이러스 구조단백질과 바이러스입자의 생물리학적 특성을 연구하였다. 바이러스입자들을 0.16% NP40 (Nonidet P-40)으로 처리할 때, 바이러스 capsid 단백질과 바이러스 막 단백질 (membrance protein)들은 다른 바이러스 구성성분들과 잘 분리되었다. 계면활성제처리에서 방출되지 않은 구성 성분들은 matrix 단백질, nucleocapsid 단백질, reverse transcriptase, integrase 및 바이러스 RNA genome로써, 이들은 subviral 구조를 형성한다. 이러한 결과는 상대적으로 다른 바이러스들의 capsid 단백질과 면역 결핍 바이러스의 capsid 단백질 (p24)를 비교할 때, 면역결핍바이러스의 capsid 단백질은 바이러스핵을 형성할 때, capsid 단백질 사이의 결합력이 매우 약한 것으로 추정된다. 또한 바이러스 조절단백질의 하나인 vpr 단백질을 함유하는 바이러스입자를 NP40 처리하여 분석하였을 때, vpr 단백질은 subviral 구조에 존재하는 것으로 나타났다.
한국 마늘에 감염되어 있는 주된 바이러스 중의 하나로 알려진 마늘 잠복 바이러스 (GMV)의 분자 구조와 병 발생 메카니즘을 이해하기 위하여, 국부 감염 숙주 식물인 Vicia faba에 연속적으로 감염시킴으로써 마늘 잠복 바이러스를 정제하였고, GMV에 대한 전신 감염성 숙주 식물로 생각되는 leek에서 GLV를 대량으로 증식시켰다. 투과전자현미경을 이용하여 바이러스 입자를 관찰한 결과, 마늘 바이러스들의 입자의 길이는 200-2000 nm의 분포를 보였으나 입자의 대부분은 600-900 nm의 범위 안에 존재하였다. 반면 순수 분리된 GLV 입자는 평균 690 nm의 길이를 보여주었고, 유연한 실 모양이었다. SDS-PAGE 분석으로 혼합 감염된 마늘 잎으로부터 분리된 마늘 바이러스의 구조 단백질은 분자량 24,500-38,000 Da의 분포를 나타내었으나, GLV 껍질 단백질의 분자량은 34,000 Da으로 나타났다.
본 연구에서는 $CD4^+$ T 세포를 일회성으로 감염시킬 수 있고 $CD4^+$ T 세포에 HIV-1 envelope 유전자를 전달할 수 있는 바이러스 입자를 생산하는 HIV-1 complementation system을 개발하였고 이 system을 이용하여 $CD4^+$ T 세포에 선택적으로 HIV-1 envelope 당단백질을 발현시켰다. 이 system은 Gag/Gag-Pol expressor와 Env expressor로 구성되어있다. Gag/Gag-Pol expressor는 바이러스 입자 생산에 필요한 구조단백질과 기능단백질을 발현시키지만 packaging signal이 결핍되어 바이러스 입자로 유전자가 들어가지 못하도록 제조되었다. Env expressor는 Tat, Rev와 envelope 당단백질을 발현시키고 packaging signal을 갖고 있어 바이러스 입자로 envelope 유전자가 들어가도록 제조되었다. Gag/Gag-Pol expressor로부터 Gag와 Gag-Pol의 발현은 Rev 단백질을 요구하였고 Env expressor로부터 Rev 단백질 이 제공될 때 Gag와 Gag-Pol 단백질은 효율적으로 발현되었다. Gag/Gag-Pol과 Env expressor로 cotransfection된 COS-1 세포에서 $CD4^+$ T 세포를 일회성으로 감염시킬 수 있는 바이러스 입자가 생산되었다. 생산된 바이러스 입자는 $CD4^+$ T 세포에 HIV-1 envelope 유전자를 전달하여 envelope 당단백질을 발현시켰고 복제 가능한 자손 바이러스의 생성을 유도하지 못하였다. 본 연구에서 개발된 방법은 $CD4^+$ T 세포에서 envelope 당단백질의 기능을 분석하고 관심 있는 유전자를 $CD4^+$ T 세포에 전달하는 바이러스 입자의 생산에 이용할 수 있다.
1. 종내의 보고된 FV의 체제법을 비교검토한 결과, 어느방법도 정제도 및 정제효률에 문제가 있음을 지적하였다. 2. 종내의 정제방법을 개량하여 정제도.정제효율이 뛰어난 FV의 정제법을 확립하였다. 3. 새로운 정제법을 이나주바이러스의 정제에 적용한 결과, 본바이러스의 정제에도 유효함이 구명되었으며 동시에 최초로 본 바이러스를 정제하는데 성공하였다. 4. 새로운 정제법으로 정제한 FV 및 이나주바이러스 입자를 전자현미경으로 관찰한 결과, 이들 바이러스입자는 구형입자이고, 그 직경은 전자는 27nm, 후자는 20nm이었다. 또 이나주바이러스 입자의 침강정수는 80S였다.
배나무잎 검은점병에 이병된 신고와 지표식물 PS-95의 잎을 전자현미경으로 세포내 미세구조를 검경한 결과 굴곡성 사상형 유사바이러스 입자가 집단으로 존재하고 있는 것을 확인하였다. 엽육유세포질에 있는 유사바이러스 입자들의 직경은 12 nm였으나 입자들의 길이는 측정하지 못하였다. 섬유사를 함유하고 있는 소포는 일반적으로 ssRNA genome을 갖는 식물바이러스에 의해 이병된 세포에서 생성된다. 본 연구에서 이 소포들은 tonoplast에 형성되었다. 배나무잎 검정점병의 이병잎을 초본 지표식물에 즙액접종하였으나 어떠한 병징도 나타나지 않았다. 또한 접목접종 전염에 의하여 전염되어 전형적인 검은점이 발병하였다. 발병된 잎에는 유사바이러스 입자가 존재하고 있었다. 이상의 결과 병징, 섬유사를 함유한 소포의 존재, 그리고 접목전염을 기초로하여 볼 때 배나무 검은점병을 일으키는 유사바이러스 입자는 closteroviruses의 하나로 생각된다.
벼오갈병바이러스(Rice dwarf virus, RDV)는 Phytoreovius 속에 속하며 게놈은 double stranded RNA의 12분절로 이루어져 있는데 전기영동상에서 크기가 큰 것부터 S1에서 S12로 명명한다. 본 실험에서는 RDV 입자 및 P12 단백질의 세포질 내에서의 소재양식을 확인하였다. 바이러스 입자 및 P12 단백질 특이적 항혈청에 protein A-gold 입자를 immunolabelling하여 전자현미경에서 gold입자의 존재양상을 관찰하였다. 바이러스 입자 특이적 항혈청을 사용한 경우에는 gold 입자가 세포질내의 바이러스 입자에 특이적으로 반응한 것이 관찰되었다. P12단백질 특이적 항혈청의 경우 gold 입자가 세포질내의 세포소기관에 특이적으로 존재하지 않고 세포질전체에 산재하여 존재하였다. 이 결과로서 RDV S12가 코드하는 단백질 P12가 세포질내에 존재함을 확인하였다.
황색 모자이크 괴저조반, 위축, 기형, colour breaking의 병미을 나타내고 있는 나리류를 한국의 남부지역에서 채집하였다. 전자현미경에 의해 2종의 바이러스 입자가 분리되어, 이들의 기주범위, 혈청반응, 조즙액중의 부활화 한계, 진딧물의 전반성, 감염엽세포에 있어서 바이러스 입자의 소재양식에 의하여 2종의 바이러스를 동정하였다. Broad bean wilt virus(BBWV) : 이 바이러스는 즙액접종에 의해 8과 23종의 검정식물에 감염이 확인되었다. 복숭아혹진딧물에 의해 쉽게 전반되었다. 내열성은 $70\%$, 내희석성은 1,000배, 내보존성은 6일이였다. 바이러스 입자의 형태는 직경 약 28nm의 소구형이다. 혈청시험에서 본 바이러스는 BBWV의 항혈청과 특이적인 반응대를 형성했다. 병엽절편의 전자현미경적관찰에서는 엽육세포의 세포질, 액포, 핵내에서 바이러스 입자의 응집괴 및 결정배열상이 확인되엇고, 특히 세포질내에서는 vesicular body의 발달이 확인되었다. Cncumber mosaic virus(CMV) : 이 바이러스 입자의 형태는 직경 약30nm의 소구형이다. 본 바이러스 CMV-Y의 항혈청과 특이적인 반응대를 형성했다. 감염엽조직의 전자현미경적관찰에서는 엽육세포의 세포질 및 액포내에서 바이러스 입자의 응집괴 도는 결정배열상이 확인되었다. BBWV와 CMV를 건전한 나리류(Lilium tigrium, L. concolor, L. auratum)에 재접종한 결과 BBWV의 접종주에서는 가벼운 병징 또는 colour breaking를 나타내었고, CMV의 접종수에서는 황색 모자이크 또는 괴저조반을 나타냈다.
Dip-method에 의한 전자현미경적 관찰의 결과, 사철나무 이병엽에서 길이 230-280nm, 폭 70-80nm의 단간형(일단이 둥근 탄환형 : bullef-shaped, 양단이 둥근 간균형 : bacilliform)의 바이러스 입자가 다수 검출되었다. 이 바이러스 입자를 사철나무 엽맥황화 바이러스(Euonymus vein clear virus : EVCV)로 명명하였다. EVCV는 피막(두께 8-10nm)을 갖고 있고, 이 피막의 표면에는 5-6nm의 염주모양의 돌기가 있다. 핵단백(nucleocapsid)은 길이 200-220nm, 폭 50-55nm의 나선구조를 갖고 있다. 바이러스 입자는 절편시료의 각종세포의 세포질내 또는 핵내와 핵막간극내에 산재 혹은 집단으로 관찰되었다. 이들 바이러스 입자의 인체는 핵막으로 둘러싸여 있었다. 대부분의 절편상에서는 바이러스 입자의 집단이 핵막의 내막과 외막 사이의 간극에서 관찰되었는데, 이것은 바이러스 입자의 성숙장을 시사하고 있는 것으로 생각된다. 어떤 절편상에서는 바이러스 입자의 피막이 핵막의 내막과 연결되어 있는 것도 관찰되어, 이 피막이 핵막의 내막으로부터 유래된 것으로 시사되었다.
가잠 다각체병 바이러스의 감염경로를 연구하기 위해서 2령 기잠에 바이러스를 접종하고 6, 12, 24, 48시간의 감염조직을 전자현미경 관찰한 결과는 다음과 같다. 1. 다각체단백질이 중장소화액에 의해 용해되어져 바이러스입자가 유리되고 섬모융모표면에서 부터 흡착되는 것이 관찰되었다. 2. 다각체 접종 후 24시간에 이미 중장원통세포핵에 현저한 증식상을 보였으며 중장피막세포 간극에서 envelope을 획득한 바이러스입자가 관찰되었다. 3. 기저막 가까이 있는 원통세포의 세포질에서 envelope을 획득한 바이러스입자들이 다수 관찰되었으며, envelope을 가지고 있지 않은 바이러스는 관찰되지 않았다. 기저막을 통과한 바이러스입자는 체강쪽으로 이행되어져 혈구세포에 집적되고 있다. 4. 접종후 48시간에 중장피막 가까이에 분포하고 있는 혈구세포 및 기관피막세포핵에서 NPV의 전형적인 증식상이 관찰되었다.
배추흰나비 P. rapae와 P. brassicae GV에 대한 봉입체 및 바이러스단백질의 물리화학적 성상을 비교 분석한 결과 전기영동법에 의한 봉입체단백질은 그 분자량이 P. rapae GV는 30kd, P. brassicae GV는 31 kb의 단일단백질이었으며, trypsin, chymotrypsin, papain 및 staphylococcus aureus V8 protease에 의한 peptide mapping에서는 두 바이러스 간에 큰 차이가 없었다. 바이러스입자단백지르이 전기영동법에 의한 분석결과, 두 바이러스 간에 큰 차이가 없었다. 바이러스입자단백질의 전기영동법에 의한 분석결과, 두 바이러스에서 각각 42개의 band가 나타났으며 고분자량 부분에서 P. rapae GV의 경우는 115, 110, 105 및 103 kd의 4개 band인데 반해 P. brassicae GV는 107 kd의 한 band만 관찰되었다. 그리고 봉입체단백질의 아미노산 분석비교에서 두 바이러스 간의 큰 차이는 없었으며 일반적으로 곤충에 많이 존재하는 산성아미노산인 aspartic acid와 glutamic acid의 함량이 많았고 염기성 아미노산에서 lysine의 함량이 특히 많았으며 봉입체단백질의 면역학적인 시험결과에서는 P. rapae GV 항혈청에 대해 두 바이러스는 공통 침강선을 형성하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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