LDH 동위효소의 4차구조 형성기작을 규명하기 위한 일환으로 웅성 흰쥐 복강내에 여러 가지 농도의 tetrodotoxin을 수차 주사한 후, 전기영동 및 densitometry에 의해 여러 조직내의 5가지 동위효소의 상대적 분포의 변화를 조사하였다. 뇌조직에서는 $H_4$ 동위효소가 현저히 증가하였고, 골격근조직에서 $M_4$ 동위 효소는 약간 증가한 반면 $M_3H$ 및 $M_2H_2$ 동위효소들은 감소되었으며, 심장조직에서는 M/H 비가 급격히 감소되었으며, 간조직에서는 소량의 $H_4$ 동위효소 형성이 나타났다. 이러한 결과들은 Donnan막 평형의 변화가 LDH 동위효소 분포의 변화를 초래할 수 있음을 시사한다. Tetrodotoxin에 노출된 흰쥐의 여러 조직내에서 $M_3H$ 동위효소 형성이 감소되는 사실로 미루어 고유한 세포질내 환경이 변화되면 3M+H 조합은 쉽게 이우러지지 않는 것으로 사료된다. 원형질 막의 어떤 sodium channel은 tetrodotoxin에 민감하지 않다는 사실이 재확인 되었다.
조류 및 포유류에서 미토콘드리아를 분리하고 모노아민산화효소(EC 1.4.3.4, monoamine oxidase)의 활성을 측정하여 미토콘드리아의 분리도를 확인하였다. 미토콘드리아 각 분획에서 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH)의 발현도를 생화학적 및 면역화학적 방법으로 분석하였다. 조류에 비하여 포유류에서는 미토콘드리아 LDH의 활성이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 미토콘드리아 LDH의 역할은 포유류보다 조류에서 중요시된다고 생각된다. 조류 및 포유류 모든 조직의 단백질양은 세포기질보다 미토콘드리아에서 적게 나타났다. 생쥐와 골든햄스터의 세포기질에서는 LDH $A_4$, $A_3B$, $A_2B_2$, $AB_3$ 및 $B_4$ 다섯 가지 동위효소 이외에 testis-specific LDH $C_4$ 동위효소가 정소 조직에서 나타났다. 닭의 미토콘드리아 내에서는 AB hybrid형 동위효소 한 종류가 나타났다. 포유류에서 미토콘드리아 LDH 동위효소들은 조직 별로 다르게 나타났다. 생쥐의 미토콘드리아 내에서는 LDH $A_4$ 및 testis-specific $C_4$ 동위효소가 나타났다. 미토콘드리아 testis-specific LDH $C_4$ 동위효소는 생쥐에서만 나타났다. 골든햄스터 미토콘드리아 내에서는 LDH $B_4$ 동위효소가 lactate oxidase로서 작용하였다. 조류 및 포유류의 대사조건 및 서식환경에 따라 미토콘드리아 LDH 동위효소의 역할도 구분되는 것으로 생각된다.
다수다얼성 옥수수의 동위효소 특성을 구명하고 자얼성성 품종을 비교하여 생육단계에 따라 여러 조직을 6% polyaclamide gel을 사용 peroxidase와 esterase 동위효소 패턴을 관찰하였던 결과는 다음과 같다. 1. 성숙한 옥수수의 엽, 간, 업소. 근 및 미숙종자의 조직에서 독특한 peroxidase의 동위효소의 존재가 확인되었다. 2. 암조건에서 7일간 자란 다수다얼성 계통의 중심주와 초엽조직은 peroxidase 도위효소의 차이를 나타내는데 효과적이었다. 3. Esterase의 동위효소에 대한 활성은 양친의 경위가 그들의 교잡종보다. 밴드수나 활성이 높았다. 4. Esterase에 대한 밴드는 암조건인 7 일 유묘상태의 중심주, 초엽, 미숙종자에서 뚜렸한 차이가 있었다. 5. 효과적인 동위효소 관찰을 위해서는 성묘보다는 유묘조직이 유리하게 보였다. 6. 흑조위축병에 감염된 옥수수 잎은 PX나 EST 동위효소에서 모두 뚜렷한 차이를 보였다.
감자전분젤을 매개로 한 수평식 전기영동장치를 이용하여 은행나무(Ginkgo biloba L.)의 megagametophyte로부터 15개 동위효소의 변이가 분석되었다. 분석된 효소 가운데서 ADH, G6PD, IDH, MPI, UGPP의 5개 효소에서는 변이가 나타나지 않았으며, 나머지 10개 효소의 11개 동위효소 구역(ACON-A, FST-B, GDH-A, GOT-B, MDH-B, MDH-C, MNR-A, PGI-B, PGM-A, 6PGD-B, SKDH-B)에서 다형성이 관찰되었다. 이중 MDH-B를 제외한 모든 구역에서 관찰된 동위효소 변이들이 1 : 1의 독립적 분리비를 보임으로써, 이들이 단일 유전자좌에 의해 조절되는 공우성 대립유전자임을 추정할 수 있었다. 한편, 동위효소 유전자좌의 3가지 조합(ACON-A : MDH-B, GOT-B : PGI-B, MNR-A : SKDH-B)에서 약한 연관관계가 관찰되었으며, 이들의 재조합 비율은 0.38-0.40로 계산되었다 (p<0.05).
용존산소(DO)의 급격한 증가에 순응된 꺽지(Coreoperca herzi)와 모래무지(Pseudogobio esocinus) 조직내 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH)의 대사와 $C_4$ 동위효소를 확인하였다. DO 18 ppm에 갑작스럽게 순응시 꺽지 LDH활성은 뇌와 간조직에서 각각 $35-39\%$ 변화되었고, 다른 조직에서는 $20\%$이내로 변화가 적었다. 골격근조직은 LDH $A_4$ 동위효소가 증가되고 하부단위체 C를 포함하는 동위효소는 감소되었다. 심장조직은 $B_4$ 동위효소가 조금 증가되었다. 신장조직도 $B_4$가 증가하고 눈 조직은 eye-specific $C_4$와 C hybrid가 감소되어 조절되었다. DO 증가에 갑작스럽게 순응한 모래무지 간조직에서 LDH 활성은 30분에서 급격하게 $150\%$이상 크게 증가되었고, 다른 조직에서는 $70\%$ 이상 변화되었다. 그리고 골격근조직은 $A_4$ 동위효소가 증가하고 다른 조직들에서는 $B_4$가 증가되었으며 특히 간 조직의 대사는 liver-specific $C_4$가 증가하고 $A_4$ 는 감소되어 조절되었다. 그러나 꺽지 눈 조직의 대사는 LDH 활성이 감소하고 eye-specific $C_4$ 동위효소가 감소되어 조절되었다. 따라서 DO증가에 순응시 모래무지는 꺽지에 비해 LDH 활성이 크게 증가되었고 동위효소의 변화정도도 크게 나타났으며, eye-spe-cific $C_4$와 liver-specific $C_4$ 동위효소는 lactate oxidase로서 대사를 조절하였다. 그러므로 환경변화에 순응하여 나타나는 대사는 종이 이전에 어떤 서식조건에 적응되었는가에 따라 다른 것으로 사료된다.
칠성장어(Lampetra japonica) 간조직 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH) 동위효소는 affinity chromatography에서 buffer를 유입한 후 용출된 분획에서 정제되었다. 대구(Gadus macrocephalus)의 liver-specific $C_4$동위효소는 열처리한 후 affinity chromatography하여 NAD+ 를 함유한 buffer에서 용출되기 시작하여 buffer를 유입한 후 $B_4$ 동위효소와 함께 용출되어, DEAE-Sephacel chromatography에 의해 정제되었다. 대구 간조직에서 열에 대한 안정성은$C_4$$B_4$$A_4$ 동위효소의 순서로 나타났다. Chromate-focusing에 의해 정제한 칠성장어 간조직의 pH 7.45 분획의 LDH 동위효소는 정제된 간조직 LDH보다 피루브산에 의한 기질저해도가 컸다. 칠성장어 간조직 LDH의 최적 pH는 7.5, liver-specific $C_4$동위효소는 pH 8.5였다. 칠성장어 간조직 LDH는 항원-항체반응에서 꺽지 $A_4$ 항체와 liver-specific $C_4$ 항체의 순서로 반응하였고 eye-specific $C_4$ 항체와는 반응 정도가 낮았다. 따라서 칠성장어 간조직 LDH는 하부단위체 A와 liver-specific $C_4$의 구조와 유사하게 진화되었으며, 하부단위체 C 는 진화속도가 매우 빠른 것으로 확인되었다. 칠성장어 간조직의 LDH는 단일 동위효소가 아니라, 하부단위체 A, B 및 C로 구성된 동위효소들인 것으로 사료된다.
눈조직의 젖산탈수소효소(LDH, EC 1.1.1.27) eye-specific $C_4$ 동위효소의 특성을 native-PAGE, Western blotting, 면역침강반응 및 효소 역학을 이용하여 연구하였고, LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성을 측정하는 조건을 제시하였다. 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus)과 큰입우럭(Micropterus salmoides) 눈조직의 세포기질에서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소가 확인되었으며 $B_4$ 동위효소보다 $A_4$ 동위효소에 유사하였다. 파랑볼우럭 눈조직의 LDH/CS는 9월에 증가하여 혐기적 대사가 높게 이루어졌다. 파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직 미토콘드리아 LDH의 전기영동상은 세포기질 LDH와 유사하였다. 눈조직의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 Preparative native-PAGE에 의해 정제되었다. 파랑볼우럭과 큰입우럭의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.2 mM과 0.1 mM 이상의 농도에서 각각 감소되었고, 피루브산 10 mM에서 5.2%, 15.8% 활성이 남아 저해 정도가 크게 나타났다. 그리고 눈조직의 LDH 활성도 젖산 22 mM과 24 mM 이상의 농도에서 각각 감소되어졌다. 파랑 볼우럭 eye-specific $C_4$ 동위효소의 $Km^{PYR}$는 0.088 mM, 큰입우럭 eye-specific $C_4$$Km^{PYR}$는 0.033 mM였으며, 세포기질과 미토콘드리아 eye-specific $C_4$ 동위효소는 ${\alpha}$-ketobutyric acid에서 활성이 높게 나타났다. 눈조직과 eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.5 mM과 Tris-HCl 완충액, pH 7.5에서 측정하는 것이 적합한 것으로 확인되었다. 실험 결과, 큰입우럭 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 파랑볼우럭 LDH eye-specific $C_4$보다 피루브산에 대한 친화력이 큰 것으로 확인되었고, 더 낮은 피루브산의 농도에서 최대 활성에 이르고, 더 높은 젖산의 농도에서 최대 활성을 나타냈다. 따라서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소에 의해 생성된 에너지가 포식 행동의 초기 반응에 사용되는 것으로 사료된다.
많은 홀몬, 성장인자 및 신경 전달물질들은 각각에 대한 세포막의 수용체와 결합하여 Phospholipase C (PLC)를 활성화시키므로서 신호를 세포내로 전달하여 세포의 성장, 대사, 신경 흥분, 수축 및 분비 등의 생리 현상을 나타내고 있다. 이 신호 전달의 중심 효소인 PLC는 현재까지의 효소 분리, 유전자 클로닝 등의 방법으로 3가지 Class에 적어도 8종유의 등위효소(Isozyme)들이 존재하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 이와 같은 등위효소에 특이적인 조절 물질을 선별할 수 있는 체계를 확립하기 위하여 새로운 동위효소의 분리 및 규명과 이 동위효소들에 대한 과발현 및 발현 세포주 개발을 추진하고 있다.
진도개와 삽사리 혈청 lactate dehydrogenase와 혈청 alkaline phosphatase의 동위효소 및 효소활성도를 분석하였다. 전기영동결과 진도개와 삽사리의 혈청에서는 5두지 종류의 LDH의 동위효소가 모두 확인되었다. LDH의 활성도는 진도개의 경우 522.53 $\pm$ 279.96(U/L)이었고 삽사리는 534.10 $\pm$ 280.35(U/L)이었다. 진도개와 삽사리의 혈청 alkaline phosphatase전기 영동상에서 는 한 종류의 동위효소만 관찰되었고 활성도는 진도개의 경우 7.61 $\pm$ 4.52(K-A unit)였고 삽사리는 10.46 $\pm$ 7. 10(K-A unit) 였다. 삽사리의 ALP 활성도는 연령에 따라 커다란 차이를 나타내었다.
분벽성 옥수수에 대한 esterase 동위효소의 유전양상을 알아보고자 acrylamide gel 6.5%를 사용하여 분벽성인 IK 계통과 대조구로 무벽성인 A-type 계통을 교배하여 얻은 $F_1$ 및 $F_2$ 종자를 28$^{\circ}C$ 암조건하에서 발아시킨 유조직 중심주를 공시하여 전기영동한 결과는 다음과 같다. 1. 본 실험에 공시된 중심주조직은 음극효소를 포함하여 총 13개의 동위효소가 확인되었으며 이동거리에 따라 유전분이 양상이 5개군으로 구분되었다. 2. 원점으로부터 0.5cm에 존재하는 E$_{0.3}$, E$_{0.4}$, E$_{0.5}$ 동위효소는 2개의 대립인자에 의해 지배되었고, E$_{0.3}$+E$_{0.4}$ 변이체는 공우성 대립인자에 의해 지배되었다. 3. 밴드의 이동거리가 1.0cm에서 1.8cm에 존재하는 E$_{1.0}$ , E$_{1.2}$ , E$_{1.5}$ , E$_{1.8}$ 의 4개의 동위효소는 2개의 대립인자에 의해 지배되었고 존재하지 않는 비활성 밴드가 우성으로 작용하였다. 한편 변이체로 나타난 E$_{1.2}$ +E$_{1.5}$ 의 동위효소는 공우성 대립인자로 작용하였다. 4. 밴드의 이동거리가 2.8cm에서 3.5cm에 존재하는 E$_{2.8}$ , E$_{3.0}$ , E$_{3.5}$ 인 세 개의 밴드는 이들 중에서 두 개씩 나타나는 밴드가 세 개 모두 나타나는 개체수보다 현저히 많이 나타났다. ($\chi$$^2$=0.327$^{**}$ ). 5. 밴드의 이동거리가 3.8cm 이상에서 나타난 동위효소는 활성이 매우 낮았고 이들 효소는 모두가 두 개의 대립인자에 의해 지배되었다. 따라서 분벽성 옥수수 중심주 조직에 대한 esterase 동위효소는 멘델식 유전법칙에 의해 지배된다고 생각된다.각된다.각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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