분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF)는 당화와 발효공정을 따로 수행하는 방법으로 최종 생성물인 글루코오스에 의해 억제 영향을 받기 때문에 반응에 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘리는 방법이 있지만, 효소의 생산비용이 비싸기 때문에 경제적인 방법이 될 수 없다. 이러한 분리 당화발효 공정의 단점을 극복하기 위해서 동시당화발효 공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)은 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행한다. 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 효모가 발효과정을 통해 글루코오스를 바로 제거하기 때문에 반응기내에서 당의 축적을 최소화할 수 있다. 따라서 동시당화발효 공정은 최종 생성물의 억제 작용을 방지할 수 있고, 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 본 연구에서는 동시당화발효에서 에탄올의 수율에 관여하는 조건들(pH, 반응온도, 효소 투입량, 반응시간)의 최적 조건을 찾는 연구를 수행하였다. 기질로는 감자전분을 사용하였고, 효소는 glucoamylase, 균주는 Saccharomyces cerevisiae가 각각 사용되었다. 동시당화발효의 최적의 조건은 pH 4, 온도 38로 나타났다. 최적의 조건으로 감자전분을 동시당화발효하였을 때 반응 18시간 후에 에탄올은 최대 수율 86%에 도달하였다.
농산폐자원을 이용하기 위한 방법으로써 Trichoderma sp. KI 7-2로 만든 koji와 내열성 효모를 사용하여 동시당화-발효와 당화액 발효를 비교하였다. 볏짚의 당화액에서는 15 mg/$m\ell$의 cellobiose가 존재하였으나 동일한 효소원을 사용한 동시당화-발효액에서는 존재하지 않았다. 효소당화법에서 는 cellulase enzyme system의 반응산물인 glucose가 cellobiose의 활성을 저해하므로 cellobiose 가 축적되었으나 동시당화-발효법에서 는 glucose가 ethanol로 발효되어 cellobiose의 축적이 없었다. Cutting mill 한 볏짚은 동시 당화-발효 과정에서는 ball mill 한 것과 같은 정도로 효과적으로 발효되었다. 이 결과로부터 cellylolytic enzyme system의 반응산물에 의한 저해 mechanism을 논의하였다. 또한 볏짚 당화시 약 10 mg/$m\ell$ 생산되는 xylose는 동시당화-발효에 아무런 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
증자하지 않은 Cassava의 생전분의 ethanol 발효생산을 위하여 Aspergilius shirousami 가생산하는 당화효소를 이용하여 단순당화 및 동시당화 발효를 하였다. Cassava 생전분의 당화률은 증자한 것에 비해 30% 정도였으며 10배의 효소를 가하여도 60%밖에 안되었으나. 동시당화-발효에서는 당화율이 크게 증가하여 ethanol 생성량이 증자한 전분에 비해 90% 이상이 되었다.
증자하지 않은 cassava 생전분의 ethanol 발효생산을 위한 동시당화 -발효의 최적조건을 검토하였다. 생전분의 분해력이 가장 좋은 당화효소의 선별에서는 Asp. shirousami27이 가장 좋았으며 발효효모는 균주에 따라 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 동시당화-발효는 pH3.6에서 가장 높았으며 발효전 6$0^{\circ}C$에서 당화효소에 의한 전당화와 발효시 교반등이 발효속도 및 발효율에 효과가 있었고, 분쇄처리도 효과가 있었다. cassava 생전분의 동시당화-발효에서 5일간의 긴 발효 기간을 요구하는데 발효중 발효액의 성분 조사 결과 중간물인 glucoserk 축적되지 않는 것으로 당화과정이 속도결정단계임을 알 수 있다.
섬유소계 바이오매스의 주요 구성요소 간의 관계에 의한 물리적, 화학적 장벽은 셀룰로오스를 발효 가능한 당으로 전환시키는 효소당화를 방해한다. 전처리의 주 목적은 셀룰로오스의 효소당화율을 향상시키기 위하여 기질로의 효소접근성을 높이는 것으로, 전처리 공정의 발전은 지속적으로 요구되고 있다. 본 연구에서는, 간단하고, 상대적으로 저비용인 암모니아수에 의한 침지공정을 전처리방법로 채택하였다. 기질로는 국내 농업 잔류물 중 생산량이 높은 볏짚을 채택하였다. 암모니아수에 의한 침지 공정은 3, 12, 24 그리고 72시간 동안 수행되었다. 그리고 동시당화발효에 미치는 전처리의 효과를 조사하기 위해, 효소당화와 동시당화발효를 30, 40 그리고 $50^{\circ}C$에서 수행하였다. 연구 결과에 따르면, 볏짚이 암모니아수에 의한 침지 처리 되었을 때, 기존의 보편적인 동시당화발효와 비교하여 상대적으로 적은 효소사용량과 낮은 온도($30^{\circ}C$) 조건에서도 당화와 동시당화발효가 수행될 수 있음을 확인하였다. 그리고 암모니아수에 의한 침지 처리는 초기 당화속도를 증가시킴으로써 24시간 이내에 발효를 종료시켰다.
해조류 중 홍조류인 K. alvarezii로부터 동시 당화 발효(SSF)를 위한 효소 당화 및 균 배양 온도를 검토하고, 기존의 동시 당화 발효(SSF) 를 개선하기 위해 2단계 동시 당화 발효(SSF)를 수행하였다. 효소 당화와 균 성장 온도를 고려하였을 때 동시 당화 발효(SSF)에 적용하는 배양 온도는 40°C를 선택하여 실험을 진행하였다. 비순치 효모(wild type)와 고농도 갈락토오스에 순치한 효모(adapted yeast to galactose)를 이용한 동시 당화 발효(SSF)를 실시한 결과 발효 156시간에 9.1 g/l의 에탄올 수율(YEtOH) 0.24와 10.2 g/l의 에탄올 수율(YEtOH) 0.27을 나타내었다. 이러한 기존의 동시 당화 발효(SSF)를 개선한 2단계 동시 당화 발효(SSF)는 에탄올 생산 수율이 0.27에서 0.35로 27.5% 증가하였으며, 에탄올 발효 시간도 156시간에서 96시간으로 61.5% 감소하였다. 이러한 연구결과는 해양 바이오매스인 해조류로부터 바이오연료 생산과정에 있어 기초적인 정보를 제공할 것이다.
Brettanomyces custersli를 이용하여 신문지의 유가식 동시 당화발효에 의한 에탄올 생산에 대한 연구를 수행하였다. 유가식 동시당화발효에 의한 에탄올 생산을 효과적으로 수행하기 위한 초기 기질 투입 농도는 8%(w/v)이었고 효소의 비용을 감안한 최적 효소 농도는 cellulase의 경우 30EPU/g cellulase, $\beta$-glucosidase와 cellulase의 부피가 0.1(활성비 1.05)이었다. 앞에서 결정된 초기 조건들을 가지고 교반식 반응기에서 수행된 유가식 동시당화발효는 26.8g/L의 에탄올을 생산성에서 회분식 동시당화발효보다 약 2배의 값을 나타내었다.
본 연구에서는 에탄올의 생산단가를 낮추기 위해, 음식물쓰레기 당화액을 이용하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시키기 위해 회분식의 반연속식 동시당화발효 시스템을 개발하였다. 음식물쓰레기 200 g와 최종효소액 (amylase 기준으로 $3.0\;U/m{\ell}$) $40\;m{\ell}$가 반응하였을 때 생산되는 환원당의 속도는 $35^{\circ}C$에서 $5.84\;g/{\ell}{\cdot}h$로서, strain KJ가 소비하는 환원당 속도는 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}h$와 비슷하여 동시당화발효의 최적온도는 $35^{\circ}C$로 결정되었다. 그리고 음식물쓰레기 당화를 위한 최적 효소농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로서 생산되는 환원당의 속도는 4.80 g/L h이었다. 이는 에탄올 생산균주가 $35^{\circ}C$에서 소비하는 환원당의 속도인 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}hr$와 비슷하므로, 효소의 최적농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로 결정하였다. Fed-batch식 동시당화발효에서 생산된 환원당을 다 소모하고 나서 12시간 단위로 음식물쓰레기를 공급하여 배양한 결과, 배양 120시간째 에탄올발효 후의 잔존 환원당 농도는 $18.3\;g/{\ell}$, 생성된 에탄올 농도는 $64\;g/{\ell}$, 에탄올의 수율은 0.45 g-ethanol/g-reducing sugar이었다. 그리하여 음식물쓰레기의 Fed-batch식 동시당화발효기술을 개발하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시킴으로써 에탄올 수율을 향상시키는데 성공하였다.
다양한 전처리 방법 중에서 묽은 황산법으로 전처리한 폐옥수수대가 효소적 당화 공정을 거쳤을 때 가장 높은 포도당 수율을 보였다. 이 효소적 당화공정을 통계적으로 분석한 결과 효소량, 고액비, 반응시간 모두 당화효율과 비례적인 관계를 보였으며 그 중에서 효소량이 가장 큰 영향을 주는 인자로 파악되었으며 최적 조건에서 76.1%의 당화 효율을 보일 것으로 예측되었다. 분리당화 발효공정에서, Saccharomyces cerevisiae는 효소 당화를 거쳐 얻은 포도당의 80%이상을 에탄올 수율 37%, 생산성 0.42 $g/L{\cdot}hr$로 바이오에탄올을 생산하였다. 동시당화 발효공정에서는 전처리된 시료가 가진 글루칸 59.5%가 0.20 $g/L{\cdot}hr$의 생산성으로 에탄올로 전환되었다. 두 공정을 통해서 얻을 수 있는 폐옥수수대 1 kg 당 바이오에탄올 양은 88 g 정도로 거의 같은 것으로 나타났다. 분리당화 발효공정과 동시당화 발효공정을 통해 강원도 폐옥수수대로부터 생산할 수 있는 바이오에탄올은 수거율 50% 기준으로 약 190만 리터로 예측되었다.
본 연구는 농업 부산물인 옥수수대(corn stover)를 이용하여 묽은 황산법(DSA; dilute sulfuric acid)과 암모니아 침지법(SAA; soaking in aqueous ammonia) 그리고 암모니아 재순환 침출법(ARP; ammonia recycle percolation)을 비교하여 각 전처리법의 특징과 장단점을 분석하였고, 동시당화공동발효를 통한 에탄올 생산을 비교하였다. ARP, DSA, SAA를 이용하여 전처리된 고형물(3% 글루칸 투입)을 15 FPU/g-glucan, 30 CBU/g-glucan의 상업용 효소(Spezyme CP와 Novozyme 188;)와 E. coli KO11 균주(ATCC$^{(R)}$ 55124)를 이용하여 동시당화공동발효를 수행하였다. 전처리 후에 남은 고형물에 있는 당의 최대이론적 에탄올 수율은 각각 87, 90 그리고 78%였다. 이것은 전처리되지 않은 원래 옥수수대의 총 당량(글루칸 +자일란) 대비 각각 69, 58, 및 74%에 해당하는 것으로 SAA의 수율이 가장 높게 관찰되었다. 또한 전처리 당화액을 이용한 동시당화공동발효 실험결과는 DSA의 당화액이 발효균주에 대하여 가장 높은 독성을 나타내었고 ARP 전처리 당화액이 그 다음으로 저해효과가 큰 것으로 나타났다. 결국 SAA를 이용하여 전처리한 후 리그닌이 풍부한 당화액은 이용하지 않고 전처리된 고형물과 동시당화공동발효 공정을 이용한 에탄올 생산이 가장 간단하면서 경제적인 공정으로 제안되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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