E. faecium MJ-14 균주의 배양 상등액에 $50\%$ 황산암모늄을 처리한 결과, 박테리오신 활성은 3,840 BU/mL으로 배양 상등액에 비해 6배 증가되었고 회수율은 약 $60\%$에 이르렀다. 이온교환크로마토그래피에 의해 용출된 획분 중 $48\∼76$번에서 항균 활성이 나타났으며, 용출물의 비활성은 35.7배 증가하였고, 회수율은 약 $41\%$였다. 그리고 겔 크로마토그래피에 의해 비활성 127,293 BU/mg인 박테리오신 단백질을 정제하였으며, 이 때 정제도는 114배, 수율은 $36\%$였다. 정제된 박테리오신 단백질을 SDS-FACE한 결과. 항균 활성을 나타내는 4.3 kDa과 5.8 kDa의 분자량을 확인하였다.
본 연구는 다양한 식물성 원료의 첨가에 따른 치킨스톡의 영양성분 향상 및 단백질 용출을 증가시키기 위한 목적으로 수행되었다. 유기산에 의한 단백질 용출 증가를 목적으로 사과를 첨가한 치킨스톡(CSA, chicken stock added apple)을 제조하여 사과를 첨가하지 않은 치킨스톡(CS, chicken stock)과 비교하였다. 시료의 당도 분석 결과 CSA군이 CS군에 비해 비교적 높은 당도를 나타냈다. CSA군의 조단백 함량을 측정한 결과, CS군과 비교하여 유의적으로 높게 나타났다. 사과 첨가로 당도가 높게 나타나 사과의 양을 줄이고 유기산 함량이 높은 토마토를 첨가한 군(CSA-T, chicken stock added apple and tomato)과 토마토 및 레몬을 첨가한 군(CSA-TL, chicken stock added apple, tomato and lemon)을 추가하여 성분을 비교하였다. 치킨스톡의 조단백 함량을 측정한 결과, CSA-TL군의 조단백질 함량은 CSA-T군에 비해 35% 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 CS군, CSA-TL군 및 시판용 치킨스톡(CCS, commercial chicken stock)군의 영양소 분석을 하여 비교하였다. 조단백질의 경우 CSA-T군은 CS군에 비해 약 79% 향상되었으며, 시판용 치킨스톡에 비해 약 6.8배 정도의 단백질을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 아미노산 분석 결과 CS군에 비해 CSA-TL군에서 glutamic acid, aspartic acid 및 각종 필수아미노산의 함량이 증가하였다. 본 연구에서 개발한 치킨스톡은 기존 제품을 대체할 수 있는 건강지향적 제품으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
rhGH-GST 융합단백질을 사용하여 재조합 대장균 세포 파쇄액으로부터 직접적으로 내포체의 solid-phase 재접힘을 수행할 수 있는 새로운 공정을 개발하였다. 그것은 고체 업자를 제거하는 동시에 초기에 목적딴백질을 흡착 포집할 수 있 는 expanded bed adsorption 크로마토그래피의 장점을 이용한 것이다. 세포 파쇄액 내 용해훤 내포체로부터의 풀린 융합단백질은 expanded bed adsorption 원리에 의해 STREAMLINE DEAE resin에 흡착되고 세포 찌꺼기 등 고체 입자물들은 위 방향 흐름에 의해 효과적으로 제거된다. Urea를 접차적으로 제거함으로써 융합단백질은 고체 matrix 표면에서 재접힘 된 후 염 놓도 구배에 의해 용출된다. 이 새로운 EBA-mediat$\xi$d 재접힘 방법은 응집현상을 획기적으로 줄이고 공정수율윤 향상시킬 뿐 아나라 공정단계 수를 줄일 수 있다. 이 공정은 우리가 알고 있는 한 세계에서 최초로 개발된 공정이며, 현재 single-chain polypeptide, affinity-tagged protein 등과 갈은 다른 행태의 단백질에 EBA를 사용한 재접힘 공정올 적용시키가 위한 연구가 진행되고 있다.
전기방사를 이용하여 polyethersulfone (PES)-bovin albumin serum (BSA) 단백질 친화막을 제조하였으며, 이때 전기방사에 의한 공정상의 문제점을 용해도가 높고, 끓는점이 높은 2,2,3,4,4,4-Hexafluoro-1-butanol (HFB)를 공용매로 사용함으로써 해결하였다. 또한 공용매는 최적의 온도, 습도 범위를 확대시켜줌으로써 친화막의 대량 생산이 용이하리라 생각한다. 제조된 친화막은 biuret test를 통하여 친화막의 색깔이 무색에서 보라색으로 변함으로써 PES 섬유 내 BSA가 존재함을 확인할 수 있었다. 완충용액의 조성 성분 중 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 세척과정에서 BSA와 L-tryptophan사이의 해리를 제어함으로써 용출과정에서 비교실험보다 약 5배의 높은 용출량을 보여주었다.
1,000l 규모의 인뇨로부터 순수한 urokinase를 정제하는 새로운 공정이 고안되었다. 2가 금속이온인 아연을 첨가하여 선택적으로 urokinase를 침전시켰으며, 이 방법은 뇨 중에 포함된 다른 단백질을 100~1,000배 농축할때도 사용할 수 있으며 10~20배의 경제효과를 얻었다. 침전물 속에 포함된 urokinate를 경제적으로 용출할기 위하여 0.1M EDTA/0.5M glycine, pH 9.0용액이 조성되었고, 용출액속에 포함된 높은 농도의 salt와 ion,뇨색소 등이 CM-Toyopeal column에 의해 신속하고 효과적으로 제거되었다. 최종적으로 사용된 benzamidine-Sepharose chromatog-raphy는 urokinase 정졔에 매우 효과적이었다. 이상의 공정을 통해, 1,000liter의 인뇨로부터 3$\times$$O^6IO$의 urokinase가 순수 정제 되었으며, 수욜은 약 50%, 정제도는 1,300배이었다. 또한 urokinase중에 12~14%의 pro-urokinase가 함유되어 있음이 확인되었다.
난백 단백질 중 ovotransferrin을 gel chromato- graphy와 heparin affinity chromatography를 통하여 분리 하였다. 1차 gel filtration의 경우에 샘플인젝션 후 65-70min(fraction No. 14) 이후에는 ovalbumin이 ovotransferrin과 혼입되어 분리되고 오히려 ovalbumin의 농도가 더 높은 분포를 보였다. 고순도의 ovotransferrin을 분리하기 위하여 다시 fraction No. 12-14을 농축한 뒤 gel filtration을 실시한 결과 ovotransferrin이 완전히 분리되지 않았는데 이는 gel filtration만의 반복을 통해서 순수한 ovotransferrin을 얻는 것이 비효과적임을 의미하는 것으로 판단된다. Ovotransferrin을 heparin affinity chromatography을 이용하여 분리한 경우 칼럼에 Fe2+를 고정시킨 후 50mM EDTA를 흘려 주었는데 ovalbumin이 5-10분경에 용출이 되었고 10-15분경에 ovalbumin과 ovotransferrin이 같이 용출되었다. 그 후에 50mM Phosphate buffer (pH 7.2, 0.15M salt)를 흘려주었는데 여전히 ovalbumin의 밴드가 보여 순수하지 않음을 확인하였다. Fe3+를 컬럼에 고정시킨 후 50mM EDTA를 흘려주었을 때 ovalbumin이 10-15분경에 용출이 되었고 15-20분경에 ovalbumin과 ovotransferrin이 같이 용출되었지만 50mM Phosphate buffer (pH 7.2, 0.15M salt free)를 흘려주었을 때 156-165분경에 ovalbumin이 혼입되지 않은 매우 순수한 ovotransferrin이 용출되는 것을 확인하였다. 위의 결과를 종합해볼 때 gel chromatography를 반복적으로 실시한 경우 보다는 heparin affinity chromatography를 이용하여 분리하고 컬럼에 Fe2+를 고정시킨 경우보다 Fe3+를 고정시켰을 때 더욱 순수한 ovotransferrin을 분리해낼 수 있었다.
한방차의 roasting 온도를 $80{\sim}140^{\circ}C$ 범위로 하여 성분 변화를 분석한 결과, 온도의 상승에 따라 수분함량이 감소하고 일부 탄화가 발생하며 조 회분 함량이 소폭 상승하였고, 조 지방 및 조단백질 함량은 소폭 감소하였다. 한방차의 고형분 용출율은 0.15~0.32%(w/w)를 나타내었는데, roasting 온도가 상승할수록 감소하는 경향을 나타내었다. 처리온도가 $80{\sim}110^{\circ}C$구간에서는 큰 변화를 나타내지 않은 반면 $110{\sim}140^{\circ}C$구간에서는 고형분 용출율이 급격히 감소하였다. 온도가 상승할수록 용출율이 감소하는 것은 내부 조직이 치밀하여 상대적으로 용출이 어렵기 때문이다. 벤조피렌 함량은 0.29~0.51ppb으로 온도가 높을수록 $B({\alpha})P$함량이 증가하였다. 처리온도와 원재료에 따라 $B({\alpha})P$ 함량에 차이가 발생하며, 내부온도는 약 $200^{\circ}C$정도지만 roaster 표면의 실제 온도는 약 $2000^{\circ}C$에 이르는데 표면과 접촉한 부분에서 $B({\alpha})P$가 생성된다. $B({\alpha})P$는 주로 음식을 조리, 가공할 때 식품의 주성분인 탄수화물, 단백질, 지방 등이 열분해 되어 생성되는 것으로 생각된다.
향미채소의 첨가가 쇠고기 곰국이나 스프스톡(soup stock)의 맛성분 변화에 미치는 영향을 연구하기 위해 양지머리 고기 국물의 단백질 용출량, 유리 아미노산, 핵산 관련 물질을 측정하고 더불어 색도 측정과 관능 평가를 실시한 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다. 1)양지머리 스프스톡의 조단백질, 유리 아미노산, 핵산 관련 물질 용출량은 대체로 가열시간에 따라 증가하였다. 2) 파(Go), 당근(Ca), 그리고 양파+당근+셀러리(A)를 첨가한 스프스톡의 조단백질 용출량은 향미채소를 첨가하지 않은 스프스톡의 용출량보다 많았다. 3) 유리 아미노산 용출량은 파 첨가 스프스톡(Go$_{5}$)에서 가장 많았으며 특히 arginine, alanine, glycine, threonine, glutamic acid가 많았다. 셀러리(C$_{5}$)와 양파 ( $O_{5}$)첨가 스프스톡 중의 유리아미노산은 향미채소 무첨가(B$_{5}$) 스프스톡보다 적었다. 4)파 첨가 5시간 가열 시료의(Go$_{5}$의 5'-IMP, inosine, hypoxanthine 농도는 다른 향미채소 첨가 스프스톡보다 높았으나 셀러리(C$_{5}$)와 양파( $O_{5}$) 첨가 스프스톡의 5'-IMP, inosine, hypoxanthine 농도는 향미채소 무첨가(B$_{5}$) 스프스톡보다 낮았다. 5) Hunter scale로 측정한 색도는 마늘 첨가(G$_{5}$) 스프스톡의 L값이 가장 낮았으며 셀러리(C$_{5}$)와 당근(Ca$_{5}$)첨가 스프스톡의 L값은 B$_{5}$값과 비슷하였다. 6) 관능 검사 결과 스프스톡의 색, 향, 맛과 전반적인 기호도에 있어서 향미채소 첨가구간의 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
미강을 혈중 콜레스테롤 저하 효과가 있는 기능성 식품소재의 원료로 활용하는 데 필요한 기초 자료를 얻기 위하여 미강 단백질의 가수 분해물을 제조하여 담즙산 결합 획분을 분리하고 일부 물리화학적 특성을 조사하였다. 미강 단백질을 탈지 미강으로부터 알칼리 추출과 등전점 침전 방법을 이용하여 제조하였다. 미강 단백질을 기질로 하여 pH-drop method로 측정한 효소의 상대적 활성과 가수분해시 가수분해율의 변화를 비교 평가하여 기질의 가수분해에 적합한 효소를 선택하였다. Esperase에 의한 가수분해물을 한외여과(MWCO : 10 kDa)하여 두 부분으로 나누었다. 각 분획물을 cholic acid를 공유결합 시킨 ${\omega}-aminohexyl$ Sepharose 4B column에 걸어, 소수성 상호작용에 의해 cholic acid와 결합하는 폴리펩티드 및 펩티드를 deoxycholate 완충용액으로 용출시켜 분리하였다. 겔투과 크로마토그래피(Sephadex G-50)를 이용하여 한외여과 여과백의 담즙산 결합물에 대해 분자량 분포를 측정한 결과, 대부분 $2\;kDa{\sim}10\;kDa$에 걸쳐 넓게 분포하였고 일부는 $0.2\;kDa{\sim}0.6\;kDa$사이에 존재하였다. 한외여과 잔류액의 담즙산 결합물에 대해서는 preparative reverse phase HPLC를 실시하여 미강 단백질 가수분해물에서 3개(R-1, 2, 3)의 Peak를 분리하였다. 각 peak의 총 아미노산과 유리 아미노산 조성을 분석하여 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 부분의 아미노산 조성을 조사하였다. 그 결과 미강 단백질 가수분해물에서 얻은 peak의 경우 proline 함량이 미강 단백질의 4배에 달했고, 평균 소수도가 높은 peak일수록 유리 아미노산이 함량이 높았으며 평균 소수도는 미강 단백질보다 다소 높은 것으로 나타났다.
체다치즈 숙성기간 중 존재하는 저온성세균을 분리하여 단백질분해능이 우수한 균주를 선발하였고 이 선발된 균주가 생산하는 효소의 특성을 연구하였다. 체다치즈 숙성기간 중 미생물의 변화를 관찰한 결과 내냉성세균이 일정하게 유지되고 있었는데 그 중 200개의 균주를 1차 선발한 후 단백질분해능이 우수한 균주 3개를 분리, 동정한 결과 P. fluorescens 두 종과 A. denitrificans였다. 그 중 활력이 가장 높은 P. fluorescens 65가 생산하는 효소를 gel filtration에 의해 정제한 결과 $190{\sim}230ml$ elution volume에서 protease가 용출되었고 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량은 47,000인 것으로 나타났으며 아미노산 조성은 Glu(14.96%)와 Ser(13.83%)의 함량이 제일 높았고 Met, Trp은 존재하지 않았다. P. fluorescens 65의 성장곡선에 따른 효소활력을 실험한 결과 세포증식이 활발한 대수증식기에서 단백질분해효소를 많이 분비함이 나타났으며 pH는 변화가 없이 일정하였다. Extracellular protease 65의 반응 최적온도는 $45{\sim}50^{\circ}C$ 사이었으며 최적 pH는 6.0으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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