우리나라에서 많이 생산(生産)되고 특히 단백질함량(蛋白質含量)이 많은 대두(大豆)로 부터 단백질(蛋白質)을 용출(溶出)하여 새로운 대두식품(大豆食品)을 만들고저 증자대두(蒸煮大豆)에 적당량(量)의 밀을 가(加)하여 Aspergillus sojae를 접종배양(接種培養)시켜 이것이 분비(分泌)하는 Portease에 의(依)하여 대두중(大豆中)의 단백질(蛋白質)을 Amino 산(酸) 내지 peptide형태(形態)로 분해용출(分解溶出)시키는데 있어서 최적용출조건(最適溶出條件)을 실험(實驗)한 결과(結果)를 요약(要約)하면 다음과 같다. 1. 원료배합(原料配合)(대두(大豆)+소맥(小麥))비(比)에 따른 단백질용출량(蛋白質溶出量)은 단위(單位) 원료당(原料當) 총용출단백질양(總溶出蛋白質量)은 콩만을 원료(原料)로한 것이 가장 많았고 용해율(溶解率)은 양자 등양배합비(等量配合比)가 가장 높은 값을 나타내나 총용출단백질양(總溶出蛋白質量)과 용해율(溶解率)을 더하여 생각할 때 콩과 밀이 10:4의 배합(配合)이 가장 적당하다. 2. 가수량(加水量)에 따른 단백질 용출량(溶出量)은 가수량(加水量)이 많을수록 용출량(溶出量)도 많았으나 용출후(溶出後) 농축(濃縮)할 것을 고려하면 6배(倍)(V/pH) 정도의 가수량(加水量)이 적당하다. 3. 소화(消化) pH는 $5{\sim}8$ 정도로 하는 것이 용출량(溶出量)이 높으며 보통의 수도물을 그대로 사용함이 용출후 중화의 필요성이 없으므로 적당하다. 4. 소화온도(消化溫度)는 $40{\sim}45^{\circ}C$ 용출기간(溶出期間)은 18시간(時間)이 적당하다. 5. 식염첨가(食鹽添加)는 부패방지기간(腐敗防止期間)을 연장시킬 수 있으나 단백질용출량(蛋白質溶出量)은 감소하는 경향(傾向)을 보였다. 6. 상기(上記)의 최적 조건으로서 시료중(試料中)의 총단백질(總蛋白質)에 대(對)하여 70%까지 용출(溶出)이 가능하였다.
콩의 수화 공정에서 수화 온도에 따른 수분함량의 변화 및 단백질 용출을 분석하기 위하여 콩의 수화 특성 및 단백질 용출특성을 확인하였다. 수화 온도가 증가함에 따라 콩의 수화 속도는 증가하는 경향을 나타내었으며, 이러한 수화 특성이 Peleg 모델을 통해 분석되었다($R^2>991$). 초기수분함량으로부터 목표수분함량(130%)까지 수화시키기 위해 25, 35 그리고 $45^{\circ}C$ 수화에서 필요한 수화시간은 각각 12.6, 3.11, 그리고 2.31시간을 나타내어 수화 온도가 증가함에 따라 목표함량에 도달하기 위한 수화시간이 급격히 짧아지는 것을 확인할 수 있었다. 수화공정에 따른 콩의 품질을 분석하기 위해 수화에 따른 단백질 용출량 또한 확인하였으며, 이 또한 Peleg 모델을 이용하여 분석하였다($R^2>0.941$). 단백질 용출 속도는 수화 온도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 나타내었으며, 수화 온도가 증가함에 따라 수화에 필요한 시간도 줄어들지만 그에 따른 단백질 용출량 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 수분함량과 단백질 용출을 분석하기 위해 개발된 두 모델을 이용하여 목표수분함량까지 수화하였을 때의 콩의 단백질 용출량을 분석하였으며, 25, 35 그리고 $45^{\circ}C$에서 각각 35.2, 93.1 그리고 103.0 mg/g을 나타내어, $25^{\circ}C$의 수화온도에서 12.6시간의 수화시간이 콩의 품질을 고려한 최적 수화공정임을 확인하였다.
본 연구에서는 다중 이온교환크로마토그래피로 리소짐을 분리하는 공정개발을 위해 Cellufine CM C-200과 Bio-rex 70 겔을 이용하여 비교 실험하였다. 난백에서 Iysozyme의 분리, 정제 및 수지의 활용성을 확인하는 실험이었다. 실험결과 Cellufine겔은 5 주기가 지나면서부터 용출분획에서 낮은 농도의 단백질이 용출됨을 확인하였다. 이는 주기가 진행될 수록 겔의 흡착능력이 약화됨을 보여주는 것이다. 또한 주기가 진행될수록 각 주기의 크로마토그램을 분석한 결과, 단백질이 겔의 작용기와 효과적으로 흡·탈착 작용을 하고 있지 못하기 때문에 용출영역의 peak가 계속해서 낮아지는 경향을 보였다. 그러나 Bio-rex 70겔은 6 주기를 수행 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 용출영역의 크로마토그램과 전기영동에서 확인하였다. Bio-rex 겔은 Cellufine겔보다 단백질과 작용기와의 결합력이 우수하였으나 순수한 Iysozyme의 정제에 있어서 적당하지 못함을 알 수 있었다. Iysozyme의 용출 이온강도가 다른 단백질들보다 더 강하기 때문에 용출용액의 소금 농도구배를 실행함으로써 단백질을 용출한다면 순수한 IysoByme을 정제할 수 있다고 생각된다. 따라서 본 실험결과 다중 이온교환크로마토그래피 공정에 효과적인 겔은 Bio-rex 70겔임을 알 수 있었다.
Chelating sepharose fast flow gel에 $Cu^{2+}$을 고정화시키고 이들과 단백질과의 친화력 정도에 의해서 용출용매를 통해 단백질을 분획하는 방식의 IMAC법을 이용하여 소의 혈장단백질로부터 IgG의 분리를 시도하였다. 대부분의 혈장단백질은 1차(0.01 M $Na_2HPO_4$, 0.5 M NaCl, pH 4.0)와 2차 용출용매(0.01 M imidazol)에 의하여 용출되었으며 역상 chromatography를 이용하여 각 분획의 단백질조성을 조사한 결과, 1차 용출용매에 의해서는 주로 albumin이, 그리고 2차 용출용매에 의해서는 IgG와 transferrin 등이 IMAC column으로부터 용출되었다. 2차 용출용매에 의해 얻어진 분획으로부터 분자량 100 kD이상의 단백질을 한외여과장치를 이용하여 농축하였을 때, IgG가 효과적으로 분리 정제 되었다.
본 연구는 상압과 가압방식으로 제조한 소뼈 용출액의 이화학 및 관능 특성을 고찰하기 위하여 일반성분, 콜라겐 유래 단백질, 콘드로이틴 황산, 유리 아미노산, 무기질 함량 및 색도를 비교하였다. 가공방식에 따른 소뼈 용출액의 고형분, 조단백, 조회분은 가열시간이 증가할수록 그 함량이 높았고, 동일 시간 동안 가열하였을 때 상압방식 용출액보다 가압방식 용출액에 더 많이 함유되어 있었다. 콜라겐 유래 단백질은 상압방식 용출액보다 가압방식 용출액에 더 많이 함유되어 있었다. 상압방식 용출액의 경우 콜라겐 유래 단백질 함량은 4시간 이상 가열할 때 증가하여 12시간 가열할 때 가장 높았고, 가압방식 용출액의 경우는 가열시간이 증가할수록 콜라겐 유래 단백질 함량이 증가하여 6시간이상 가열했을 때는 유의적 차이가 없었다(p>0.05). 콘드로이틴 황산은 동일 시간을 가열하였을 때 상압방식 용출액보다 가압방식 용출액에 유의적으로 더 많이 함유되어 있었다(p<0.05). 동일 시간 동안 가열하였을 때 칼슘과 마그네슘은 상압방식 용출액에 유의적으로 더 많이 함유되어 있었고, 인, 소듐, 포타슘은 가압방식 용출액에서 더 많았다(p<0.05). 상압방식 용출액이 가압방식 용출액보다 $L^*$ 값이 유의적으로 높았고(p<0.05), $a^*$ 값과 $b^*$ 값은 전반적으로 가압방식 용출액이 높았다. 상압방식 용출액은 가열시간이 증가할수록 탁도가 높았지만, 가압방식 용출액은 가열시간에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 전반적으로 상압방식 용출액이 가압방식 용출액보다 탁도가 높았다. 관능적으로는 가압방식 용출액이 상압방식 용출액보다 갈색도, 투명도, 소 비린내, 소 비린 맛, 유황 냄새가 강하였는데, 이러한 특성은 가열시간이 증가할수록 더 강했다. 따라서 본 연구를 통하여 영양학적인 측면에서는 가압방식으로 제조한 소뼈 용출액이 우수하였지만, 관능적 측면에서는 전통적인 상압방식으로 제조하는 방법이 좋았다고 판단한다.
본 연구에서는 알칼리 사용에 따른 갈변을 최소화하고 영양적으로 우수한 천마 단백질을 보다 효율적으로 추출하기 위하여 용출 및 침전 pH에 따른 단백질의 갈변도와 함량을 측정함으로써 탈지 천마 단백질 알칼리 추출의 최적 pH 조건을 설정하고자 하였다. 천마의 수분은 약 15%로 측정되었으며, 대부분 탄수화물로 구성되어 있었고, 단백질의 함량이 높은 것으로 확인되었다. 이러한 단백질을 다양한 pH에서 용출시킨 결과 pH가 증가함에 따라 용출된 단백질의 양이 증가하였으며, 갈변도 또한 증가함을 보였다. 침전 pH에 따른 단백질 함량은 pH 4에서 침전된 pellet이 가장 많은 함량을 나타내었으며, 상등액의 단백질 함량 또한 대부분 pH 4로 침전시킨 경우 가장 적은 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 단백질의 회수율도 침전 pH가 4일 때 가장 높은 값을 나타내었다. 따라서 갈변도와 단백질 함량을 고려한 탈지 천마 단백질 추출을 위한 최적조건은 용출 pH 9와 침전 pH 4로 결정되었다.
알칼리를 이용하여 탈지미강에서 단백질을 추출하기 위해 용출 pH(8, 9, 10, 11, 12) 5개 구간과 등전점 침전 pH(2, 4, 6) 3개 구간을 설정하고 각 pH 구간에서의 회수된 단백질 함량과 갈변, 전기영동 패턴 및 최종 수용성 단백질의 회수율을 비교 확인하였다. 용출 pH가 증가할수록 수용성 단백질의 회수율은 증가하였으나 동시에 갈변현상도 증가하였다. 등전점 침전 pH는 4에서 가장 많은 단백질을 회수할 수 있었다. SDS-PAGE 결과, 사용한 pH에 따라 추출된 단백질의 주요 패턴은 뚜렷한 차이가 없었으나, 높은 알칼리조건이 35 kDa 이하의 단백질 추출에 좀 더 용이하였다. 각 pH 구간별 용출 대비 수용성 단백질 회수율은 평균 31.5% 이었다. 용출 pH 11 및 침전 pH 4 구간에서 46.95%의 가장 높은 회수율을 나타냈으나 갈변이 급격히 증가하였다. 따라서 37.65%의 회수율을 나타낸 용출 pH 10 과 침전 pH 4 구간이 미강 단백질의 최적 추출조건임을 확인하였다.
참깨박에 함유되어 있는 불용성 형태의 단백질을 가용성 형태의 단백질로 용출시키기 위하여 Bacillus sp. CW-1121이 생성하는 효소를 작용시켰다. 이때 참깨박의 단백질 용출을 위한 최적 pH는 7.5였으며, 최적 온도는 $40^{\circ}C$였고 최적 조건하에서 2시간의 소화로 약 60%의 용해도를 보였다. 단백질의 용해도는 참깨 단백질이 pH4.5에서 가장 낮아 등전점을 보였고, pH3.0과 pH6.0 이상에서는 크게 증가하였다. 효소처리 참깨박 단백질을 전기영동한 결과 수용성 단백질은 4개, 염용성 단백질은 2개의 밴드가 관찰되었다. 분리 단백의 아미노산 조성은 수용성 단백질의 경우 serine이 17.24 mg/g, 염용성 단백질은 glutamic acid가 10.77 mg/g, 유리아미노산은 glutamic acid가 6.55 mg/g으로 가장 많이 함유되어 있었으며 특히 필수아미노산의 조성도 상당히 좋은 편이었다.
폐단백질을 활용하는 방도의 하나로 폐단백질 자원으로 부터 불용성 단백질의 분리 효율성을 높이고 기능성을 개선하기 위하여 protease를 생산하는 Aspergillus sp. MS-18균주를 토양으로 부터 분리하고 이 균주가 생산하는 효소를 이용한 단백질 추출 최적 조건을 규명하고 추출 단백질의 기능성을 비교 검토하였다. 참깨박 단백질의 용출을 위한 최적 pH, 최적 온도, 최적 처리 시간과 최적 첨가 효소량은 pH 9.0, $60^{\circ}C$, 8시간 처리, 40 unit 이었다. 효소 처리된 참깨박 단백질은 효소 처리의 경우 대조구에 비해 기포 형성력과 기포 안정성이 매우 증가하였고, 참깨박 단백질의 유화력은 효소 처리구의 경우 전 pH의 범위에서 유화력과 유화 안정성이 매우 증가하였다. 참깨박 단백질의 유지 흡착력과 수분 흡착력은 효소 처리구가 대조구에 비해서 높은값을 나타내었다.
두유박에 함유되어 있는 불용성 형태의 단백질을 Bacillus subtilis IAM 1071 natto가 생산하는 효소를 이용하여 가용성 형태의 단백질로 용출시키기 위하여 효소작용 최적 조건으로서 pH, 온도 및 소화 시간을 결정한 다음 추출액의 ·아미노산 조성을 분석하였다. 두유박의 단백질 용출을 위한 최적 pH는 7.5였으며 최적온도는 $45^{\circ}C$였고 최적조건하에서 15시간의 소화로 63%의 단백질 추출율을 보였다. 추출액의 아미노산은 고르게 분포되었으며, 특히 필수 아미노산의 조성도 상당히 좋은 편이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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