경구 투여가 비교적 어려운 단백질 약물을 생체적합성이 우수하고 생분해성을 가진 펙틴을 이용하여 목적하는 colon에 전달하고자 하였다. 이온결합을 통해 펙틴, 펙틴-알긴산비드를 제조할 수 있었고, 단백질 약물인 BSA를 포함하여 방출을 행한 결과, 비드의 건조온도가 높을수록 방출률이 높은 경향을 보인 반면, 동결건조된 비드가 가장 높은 방출을 나타냈다. 또한, 가교제의 농도를 높게 처리한 비드일수록 방출률이 낮았다. 경구 투여 후 colon에 도달할 것으로 예상되는 5시간 후에 펙틴 분해효소를 처리한 결과, 효소 처리하지 않은 비드에 비해 급격한 방출이 일어났다. 이러한 결과로 colon내에 존재하는 미생물이 분비하는 효소에 의해 펙턴 비드에 포함된 약물이 방출될 것으로 판단된다. 따라서, 경구로 투여된 펙틴 비드 안의 약물이 소화기관에서 안정하게 통과하고 colon에서 방출되어 효과를 나타낼 것으로 판단된다.
생분해성 고분자인 Poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)와 약물 단백질로 약물 중합체를 만들기 위하여 초임계 나노 입자 제조 공정중 하나인 PGSS법을 이용하여 연구를 수행하였다. 초임계 이산화탄소에 의해서 고분자 PLGA의 유리전이온도($T_g$)를 강하시켜 가소화시키면서 단백질을 용기 내에서 혼합하였다. 고분자 PLGA에 캡슐화 된 단백질의 입자를 얻기 위해 고압 용기에 들어있는 시료를 노즐을 통하여 대기압으로 이산화탄소를 분사시켰다. 입자의 형태, 입자 크기 그리고 크기 분포에 대한 영향을 알아보기 위해서 고압 용기 안에서 초임계 이산화탄소를 이용하여 공정변수들을 조작함으로서 PGSS 실험을 하였다. 입자는 거칠고 불규칙하며 표면에 기공이 생성되었음을 확인하였다. 제조된 입자의 크기와 크기분포는 과포화도, 핵 생성시간 등으로 설명하였다. 제조된 입자 내의 protein의 활성도 저하는 거의 없었다.
말징버섯 Calvatia craniformis의 culture broth 40 liter를 여과하여 얻은 균사채를 열수 추출하여 진한 갈색 건조분말(Fr. A) 13.1g을 분리하였다. Fr. A에 대하여 DEAE-cellulose ion chromatography를 시행하여 중성분획인 흰색 분말 (Fr. B) 2.50g을, 산성분획인 갈색 분말 (Fr. C) 3.50g을 각각 분리하였다. Fr. B 500mg에 대하여 Sepharose CL-4B gel filtration chromatography를 시행하여 흰색분말 Fr. D(Calvatan) 350mg을 분리하였다. Calvatan 350mg에 대하여 Con A-Sepharose 4B affinity chromatography를 적용하여 미흡착 분획인 Fr. F($\alpha$-form)와 흡착 분획인 Fr. E ($\beta$-form)로 정제하였다. 항암작용의 기전을 구명하고자 마우스에 대하여 면역학적 실험을 시행하였다. macrophage의 활성에 대한 영향을 조사하였던 바, 투여군의 활성화된 macrophage에 의해 유리되는 superoxide anion의 양은 대조군에 비해 1.4배 증가하였고 Calvatan 투여군의 용혈반 형성세포(PFC)는 대조군에 비해 3.1배 증가하였다. 화학 분석에 의해, Calvatan은 다당체 87.2%, 단백질 1.8% 및 hexosamine 1.3%로 구성되어 있었다. 따라서 항암성 분획들은 protein-bound polysaccharide임을 알 수 있었다. 또한 각 분획의 다당체를 구성하고 있는 단당류는 glucose, galactose, mannose 및 xylose 였으며 단백질 부분은 16종의 아미노산으로 구성되어 있었다. IR 스펙트럼은 3300-3400 $cm^{-1}$에서 0-H stretching frequency, 2900 $cm^{-1}$ 에서 C-H stretching frequency, 1630 $cm^{-1}$ 에서 C-0 stretching frequency. 1000-1100 $cm^{-1}$에서 C-H 및 C-0 bending frequency를 나타내는 다당체의 전형적인 특성을 보여주었다.을 보여주었다.
본 연구에서는, 무분별하게 사용되고 있는 민간요법의 과학적인 접근의 일환으로 인슐린 비의존형 당뇨환자를 대상으로 당뇨치료약물을 복용하는 당뇨군과 당뇨치료약물을 복용하지 않는 당뇨군 그리고 정상군으로 나누어 각군 모두에게 누에분말을 복용시켜 혈당 및 혈중 당화헤모글로빈, 인슐린, 그리고 혈중 지질농도에 미치는 영향을 관찰하여 요약하면 다음과 같다. 1) 신장, 체중, BMI, 둔부둘레는 세군간에 차이가 없었다. 허리둘레는 기존의 당뇨치료약물과 누에분말을 동시에 투여받는 당뇨군에서 다른 두 군에 비해 유의적으로 높아 WHR은 당뇨치료 약물을 동시에 복용한 당뇨군>누에분말만 복용한 당뇨군>정상군의 순으로 나타났다. 누에분말을 투여받는 동안 체중의 변화는 관찰되지 않았다. 2) 당뇨군과 정상군 사이에 열량 및 열량구성비에는차이가 없었으며, 연구 진행동안의 유의적인 변화도 관찰되지 않았다. 실험기간동안 총열량 섭취량은 남자의 경우, 권장량의 87.7%, 여자의 경우, 권장량의 86.2% 를 섭취하고 있었다. 하루동안 누에분말로 공급된 단백질 함량은 0.279이었으며 식이로의 단백질섭취는 남녀 각각 권장량의 97.5%. 108.3%를 섭취하고 있었다. 총 열량구성비는 남자의 경우 탄수화물 단백질. 지방이 68 : 15 : 17, 여자의 경우 69 : 16 : 15이었다. 3) 당뇨치료 약물을 누에분말과 동시에 복용한 당뇨군에서 누에분말 복용후 공복시 혈당이 7.4%, 식사후 2시간의 혈당이 19.4% 감소하는 경향이었고, 누에분말만 섭취한 당뇨군은 누에분말 복용후 혈당이 공복시 9.7%, 식사후 2시간시 23.4%의 감소경향을 나타냈다. 공복시와 식사후 2시간의 혈당 모두 누에분말 섭취후에도 정상범위보다 다소 높았으나, 혈당감소율(%)은 당뇨치료약물을 동시에 복용한 당뇨군에 비해 누에분말만 섭취한 당뇨군에서 큰 경향이었다. 정상군의 혈당에 는 큰 변화가 없었다. 4) 당뇨치료 약물을 동시에 복용한 당뇨군이 누에분말만 복용한 당뇨군에 비해 당화 헤모글로빈이 낮았고 정상군은 더 낮았다. 4주동안 누에분말 복용 후 당화헤모글로빈의 변화는 관찰되지 않았다. 5) 본 연구 대상자들의 공복시 인슐린 농도는 당뇨치료 약물을 동시에 복용한 당뇨군에서 누에분말만 복용한 당뇨군과 정상군에 비해 높았다. 누에분말 복용에 따른 공복시 인슐린 농도의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 6) 누에분말 복용에 따른 각 군간의 혈중 지질 농도의 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 혈중 중성지방의 농도는 당뇨치료 약물을 동시에 복용한 당뇨군의 경우 8.5%, 누에분말만 섭취한 당뇨군의 경우 9.0% 그리고 정상군은 3.4%가 감소되는 경향을 나타내었다.
나노 또는 마이크로 크기를 가지는 구형의 약물 전달체이다. 그러나 일반적인 리포솜은 혈류 순환시 혈장 단백질과의 흡착이 일어나 안정성이 떨어지고, 세망내피계의 대식세포에 의해 옵소닌작용이 일어나 혈중에서 쉽게 소실되는 단점이 있다. 이에 본 연구에서는 모델단백질로 소혈청 알부민(BSA)을 사용하였고, BSA의 등전점보다 높은 pH를 나타내는 수용액에 용해하여 BSA가 음이온성을 갖도록 제조하였으며 이를 양이온성 리포솜 표면에 정전기적 인력에 의해 결합시켰다. 그리고 리포솜 표면에 코팅된 알부민을 60oC 이상의 온도에서 변성시켜 알부민이 코팅된 리포솜을 제조하였다. 대조 리포솜과 양이온성 리포솜의 입자크기는 104±1nm를 나타내었고, 변성된 알부민이 결합된 리포솜은 109±1nm의 입자크기를 나타내었다. 모델약물로서는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 사용하였고, 이온구배에 의한 리모트 로딩 방법을 사용하여 리포솜 내부에 DOX를 봉입시켰다. 혈장 내에서 리포솜의 안정성을 평가한 결과, 알부민이 결합된 리포솜은 입자크기의 변화가 관찰되지 않았고, 대조 리포솜과 양이온 리포솜에 비해 단백질 흡착이 억제되어 변성된 알부민으로 코팅된 리포솜은 혈류 내에서 장기 순환이 가능한 약물전달체로서 유용할 것이라 사료된다.
전기분무에서의 전기유체 역학적 힘에 의한 표면 에너지의 조절은 간단한 입자 크기 조절, 단분산성, 높은 회수율, 그리고 약한 가공조건과 같은 이점을 제공할 수 있다. 이러한 이점은 단백질 약물전달체 제조에 적절할 것으로 예상되어, 본 연구에서 전기분무법을 이용하여 단백질 약물의 나노포집을 시도하였다. 모델 단백질인 알부민을 단축 혹은 동축 전기분무로 가공하였고 키토산, 폴리카플로락톤(PCL), 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 등이 포집물질로 사용되었다. 효율을 최대로 높이기 위해 분무액의 전기전도도, 유속, 전기포텐셜 구배의 거리 등과 같은 가공변수들이 조사되었다. 키토산 시스템에서 입자크기에 대한 공정 변수의 영향은 유속이 늦어질수록, 노즐과 집적부 사이의 거리가 가까울수록 입자 크기가 감소하는 것을 알 수 있었다. PCL 시스템에서는 단축 전기분무의 경우 유속이 늦어질수록, 동축 전기분무의 경우 내부와 외부 물질의 유속비가 클수록 입자 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 전기분무 노즐에서 생성된 초기 입자들은 좁은 입자 크기 분포를 보였으나, 그것들이 집적부에 도달했을 때 입자들이 응집되는 경향이 있었다. 이러한 전기분무법에서 PCL, PEG, 키토산을 사용한 알부민의 효과적인 나노 포집은 12 kV 이상에서 성공적으로 이루어졌다.
목적 : 간질은 전세계인구의 0.5%에서 발병하며 유전적 성향이 많고, 이는 중추신경계의 과 흥분성에 기인한다고 알려져 있다. 최근 프로테오믹스기법의 발달로 질병관련 단백질 동정이 활발히 연구되어지고 있다. 더불어, 간질의 진단은 영상기법 및 뇌파 분석 등이 이용되고 있으나, 가장 손쉽고 경제적인 혈청단백질을 이용한 진단법은 확립되어 있지 못하다. 그러므로 본 연구에서는 측두엽 간질환자의 혈장 단백질을 분석하여 간질의 진단 표지단백질 및 질병관련단백질을 발굴하고자 하였다. 방 법 : 저자들은 8명의 측두엽 간질환자와 8명의 정상인 혈청을 비교하였다. 결 과 : 간질환자의 혈청에서 정상 혈청단백질과 유의하고 일관성 있는 차이를 보이는 12개의 단백질을 발견하였다. 그 중, 6개의 단백질을 동정하였고, 6개의 단백질은 동정하지 못하였다. 더불어, haptoglobin Hp2, PRO2675, immunoglobulin heavy chain constant region gamma 2와 1개의 명명되지 않은 단백질 및 3개의 미지의 단백질을 포함한 7개의 단백질은 간질환자의 혈액에서 증가하였다. 반면, MHC class I antigen, plasma retinol-binding protein precursor 및 3개의 미지의 단백질을 포함한 5개의 단백질은 감소하였다. 결 론 : MHC class I antigen, immunoglobulin heavy chain constant region gamma 2 및 수술 전에 증가하였던 3개의 미지의 단백질 중에서 1개, 감소하였던 3개의 미지의 단백질 중에서 2개를 포함한 모두 5개의 단백질은 간질을 일으키는 뇌 부위 절제 후 정상으로 회복되었다. 이는 이런 단백질들을 측두엽 간질의 진단 및 경과관찰인자로서, 활용할 수 있음을 시사한다. 나아가, 이러한 단백질들은 간질의 병태 생리 연구 및 새로운 치료약물개발의 표적 단백질로 활용될 수 있을 것이다.
알코올의 농도 변화에 따른 실크단백질의 구조전이 효과에 대하여 살펴보기 위하여 백옥잠 누에고치를 이용하여 실크단백질 용액을 제조하였다. 알코올의 농도를 100%, 70%, 50%로 조절하여 제조한 실크 비드의 적외선 분광 분석을 하였다. 고농도(100%) 알코올로 처리한 실크단백질은 전형적인 ${\beta}-sheet$ 구조를 반영하는 $1265cm^{-1}$ 부근에서 흡수대를 보였으며 모델 약물로 사용한 4HR의 특성 피크는 관찰되지 않았다. 알코올의 농도를 70%, 50%로 조절하여 처리한 경우에는 모델 약물의 흡수대인 $2933cm^{-1}$ 부근, $1069cm^{-1}$ 부근, 그리고 $973cm^{-1}$ 부근의 흡수대가 발현되었다. 이러한 결과는 알코올의 농도에 따라 조성되는 실크단백질의 미세 구조에 차이가 있음을 나타내며, 보다 정밀한 실크단백질 구조 제어를 위한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.
페메트렉시드(pemetrexed, $alimta^{(R)}$)는 중피종(mesothelioma)과 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer)을 비롯한 다양한 암종에서 엽산(folate) 대사과정에 관여하는 대사물질의 활성을 억제하여 항암효능을 나타낸다. 다중표적 항암제 (multitargeted antifolate)인 pemetrexed는 엽산의 세포내 주요 이동통로인 reduced folate carrier(RFC)를 통해 세포 내로 유입된 후 folylpolyglutamate synthetase (FPGS)에 의해 폴리글루타민산염(polyglutamate) 유도체로 활성되고 thymidylate synthase (TS)와 dihydrofolate reductase (DHFR)를 표적하는 것으로 알려져 있다. 조직형이 서로 다른 비소세포폐암 세포주를 선정하여 pemetrexed의 대사과정에 관여하는 유전자들의 단일염기서열 다형성을 조사하고, mRNA와 단백질의 발현 정도를 비교하여 pemetrexed의 세포독성 효과와의 상관성을 분석하였다. 4개의 비소세포폐암 세포주인 A549, PC14, HCC-1588과 H226에서 RFC, FPGS, TS와 DHFR의 유전형을 조사하였다. Pemetrexed의 약물의 감수성을 알아보기 위해 real-time PCR과 Western blot 방법으로 mRNA 발현과 단백질 발현 정도를 비교하였고, SRB 법으로 약물에 대한 세포독성 효과를 측정했다. PC14 세포주와 H226 세포주에서는 약물처리 전 RFC와 FPGS의 mRNA 발현이 높은 것으로 나타났고, $IC_{50}$값이 각각 $0.08{\pm}0.01\;uM$과 $0.07{\pm}0.01\;uM$로 pemetrexed에 대한 감수성이 높은 것을 알 수 있었다. A549 세포주에서 TS의 유전형이 2R/2R일 때 mRNA발현이 증가하고 pemetrexed의 약물 저항성과 관련이 있었다. 반면, TS의 유전형이 3R/3R로 나타난 H226에서는 mRNA 발현이 낮은 것을 알 수 있었지만 pemetrexed의 높은 감수성과 관련이 있었다. 세포주 모두에서 pemetrexed 약물처리 후 DHFR의 mRNA 발현은 약물처리 전보다 낮아지는 경향을 보였지만 단백질 발현은 오히려 증가하는 상반된 결과를 보였다. 또한 DHFR 프로모터에 위치한 -1726C>T, -1188A>C SNP는 서로 연쇄 불평형 상태(linkage disequilibrium, LD)에 있었다. 연구결과에서 pemetrexed의 세포독성 효과는 약물 대사과정에 관여하는 여러 분자들의 유전형과 발현 정도에 의해 결정되는 것을 알 수 있었고, 다양한 분석결과를 토대로 항암효능을 평가하는 것이 필요하다고 생각된다.
동물, 곤충, 해조류 등으로 부터 얻어진 독소는 해로운 것으로 알려져 있지만 의학적으로 유용한 화합물을 내포하고 있다. 본 연구는 이러한 점에 착안하여 독사, 또는 곤충의 독 30여종을 대상으로 위암 세포인 SNU-1에 대해서 MTT assay에 의한 세포 독성 시험을 실시하였다. 이 중 세포 독성 활성이 가장 놓은 코브라 계통인 Ophiphagus hannah의 독으로 부터 세포 독성 물질의 정제를 시도하였다. HPLC-GPC와 HPLC-lEX 또는 RP-HPLC를 이용하여 정제하였고 각 분획들을 암세포주에 대해서 시험하였다. TSK-2000SW로 부터 2개의 분획을 얻어 분획 I에서 $IC_{50}$/ 의 값이 0.5 - 3 $\mu\textrm{g}$/ml의 범위 내에서 확인되었다. 분자량이 작은 분획 II에서는 세포독성이 작게 나타났지만 농축하여 성분 분석을 시도하였다. 분획 I을 RP-HPLC를 이용하여 TFA와 acetonitrile의 linear gradient에 의해 더욱 분리를 하였고, phopholipase $A_2$ 활성의 가능성도 측정하였다. 분획 II는 Mono S 칼람을 이용하여 ammonium acetate농도에 따른 pH gradient에 의한 분리를 시도하여 순도를 SDS-PAGE에 의해서 확인하였다. 각각의 크로마토그리피로 부터 얻은 분획에 대해서 세포 독성을 실시중에 있으며 성질도 동정중에 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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