• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제21권2호
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• pp.177-182
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• 1994

ICR female mice aged 3 to 4 weeks, were stimulated with 7.5 IU PMS injection. At 48-52h post-PMS injection, ovaries were dissected out and oocytes-cumulus complexes(OCCs) were divided into three groups, cumulus-free oocytes(O), cumulus-free oocyte cocultured with cumulus cells(O+C) and OCC. The oocyte were cultured in TCM199 containing various protein sources, FCS, BSA or PVP with gonadotropins(Gns) for 24h. Spermatozoa were collected from cauda epididymis and capacitated in T6 + BSA for 2h. After oocyte maturation in vitro(IVM) in different experimental groups, matured oocytes were inseminated with the capacitated spermatozoa in T6 + BSA for 6h. In the groups of IVM in TCM + BSA or PVP, fertilization(IVF) did not occur efficiently. However, increased fertilization was found in TCM+ FCS group. The oocytes groups, with cumulus cells showed decreased polyspermy in FCS group (O; 31.8 %, O + C; 12.2 %, OCC; 16%), the addition of Gns did not prevent polyspermy in all three groups. The rates of fertilization increased in zona-free oocytes in PVP group. This results showed that culture system for IVM and IVF could be improved. Furthermore, PVP can be used for the substitution of protein source during maturation, and its low rate of fertilization has been found due to zona hardening which occurred in FCS-free medium.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.327-337
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• 2001

본 연구는 superoxide dismutase (SOD)가 동결-응해 돼지정자의 lipid peroxidation과 체외수정능력에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 동결-응해 정자는 10 units/$m\ell$의 SOD가 첨가된 배양액에 의해 처리했을 때 가장 높은 정자생존율을 나타냈으나 서로 다른 농도에 의한 차이는 인정되지 않았다. 그러나 SOD농도에 관계없이 정자처리 직후의 생존율은 120분간 배양 후에 비해 유의적(P＜0.05)으로 높은 생존율을 나타냈다. 또한 정자처리 후 배양시간이 0, 60 및 120분으로 길어짐에 따라 정자의 첨체반응 유기율이 증가하였지만 SOD 첨가 또는 무첨가구 사이에서 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 한편, 체외수정시 1 unit/$m\ell$의 SOD를 첨가한 경우 0, 10 및 100 units/$m\ell$ 첨가시 보다 유의적(P＜0.05)으로 높은 정자침입율을 나타냈으며, 10과 100 units/$m\ell$의 SOD 첨가시 낮은 다정자 침입율을 나타냈다 (P＜0.05). 정자의 peroxidation은 malondialdehyde의 생성에 기초를 두고 평가하였는데 SOD 무첨가에 비해 첨가농도가 높아질수록 malondialdehyde의 생성이 낮아졌지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 또한 동결-융해된 정자는 sulfhydrl(-SH) group의 용량을 측정한 결과 SOD무첨가시 보다 첨가시 높은 용량이 측정되었지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 한편, 동결-융해된 정자가 체외에서 성숙시킨 난자의 투명대에 접착하는 정도를 평가한 결과 SOD 무첨가 보다는 첨가농도가 높아짐에 따라 접착정자수가 증가하였으며 100 units/$m\ell$ 첨가시 유의적(P＜0.05)으로 높은 접착정자 수를 나타냈다 본 연구의 결과로부터 SOD는 돼지 동결-융해정자에 있어서 난자의 투명대 접착능력의 증가와 함께 체외수정능력 향상에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.245-255
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• 2004

포유동물 난자의 체외수정은 외래유전자 도입에 의한 형질전환동물 생산과 우수한 형질을 가진 개체의 보존, 인간의 불임연구 등과 같은 수정란이식 기술로서 널리 이용되고 있다. 돼지 난포란을 이용한 체외수정란의 생산은 초기단계인 체외성숙 기술의 미확립, 그로인한 체외수정 시 높은 다정자 침입율과 불완전한 웅성전핵 형성 몇 체외발달능 정지현상(cell blocking) 등 어려움 때문에 아직도 다른 가축보다 양질의 수정란을 생산하기가 어려운 것으로 알려져 있다. 이와 같은 것을 해결하기 위하여 많은 연구자들은 배양액내에 hormon, growth factor, antioxdants 등과 같은 외인성 인자들을 첨가하고 있다. 이들 인자 중 antioxdant는 free radical을 소거하고 과산화물 생성을 억제하여 난자를 산화적 스트레스로부터 보호한다. 따라서 본 연구는 돼지 난포란으로부터 체외수정란의 생산에 있어서 배양액내 cysteine, catalase 및 glutathione의 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 체외배양에 어떤 영향을 미치는지를 검토하였다. 실험 1은 체외성숙용 배양액인 TCM-199 용액에 catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 2는 성숙된 난자의 체외수정용 배양액인 mTBM 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 3은 체외성숙 및 체외수정된 난자의 체외배양용 배양액인 NCSU-23 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)을 첨가하여 배반포로의 배 발달율을 관찰하였던 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙시 catalase의 경우는 500U 첨가군의 27.2%로 무첨가군의 15.4%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 한편 glutathione의 경우 배반 포로의 배 발달율은 무첨가군과의 차이는 없었다. 그러나 1.0mM 첨가군에서 상실배까지의 배 발달율인 72%는 무첨가군의 53.9%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 2. 체외수정시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 3. 체외배양시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 이상의 결과를 종합적으로 하면 돼지 난포란을 이용한 배반포의 체외생산에 있어서 배양액내 항산화제의 첨가는 체외성숙단계에서만 효과적이었다. 이것은 아마도 항산화제가 체외성숙 시 난포란 내에서 일어나는 여러 가지 생화학 반응의 처리시간과 관련하여 활성화시킴으로써 난포란의 생존력을 높인 것이라고 사료되기 때문에 앞으로는 돼지 난포란의 효율적인 체외성숙에 대해서 배양액내 첨가물질은 물론 나아가서 방법론적인 측면에서 더욱 연구되어져야 할 것이다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.101-107
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• 2006

본 연구는 돼지 수정란의 체외 성숙 및 체외 배양액의 retinol 첨가 효과를 규명하기 위하여 체외 성숙 및 체외 배양액에 retinol을 첨가하여 수정란의 체외 발달에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. 체외 성숙 배양액에 retinol을 첨가한 결과 성숙율은 $66.7{\pm}6.0{\sim}69.2{\pm}5.3%$으로 각 처리구 간의 유의적인 차이가 없었다(p>0.05). 체외 수정 후 배반포로의 발달율은 $5{\mu}M$ 첨가구에서 $20.4{\pm}2.6%$의 발달율을 나타내어 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났으며, $10{\mu}M$ 첨가구에 있어서는 분할율과 배반포로의 발달율이 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 낮게 나타났다. 정상 수정율은 $59.3{\pm}9.6{\sim}73.0{\pm}7.3%$로 처리구간에 차이가 없었다. 다정자 침입율은 처리군 간에 유의차는 인정되지 않았다(p>0.05). 배반포로의 발달 후 세포수를 비교한 결과 대조구($29.8{\pm}1.0$)에 비해 $5{\mu}M(37.0{\pm}1.6)$ 첨가구에서 유의적으로(p<0.05) 많은 세포수를 나타내었다. 체외 배양액에 retinol을 첨가한 후 발달율을 조사한 결과, 난할률, 상실배 및 배반포로의 발달율에서 모두 효과를 나타내지 못하였으며, 특히, $10{\mu}M$의 처리구에서는 대조구를 비롯한 타 처리구들보다 유의적으로(p<0.05) 발달율이 낮게 나타났다. 체외 성숙 배지와 체외 배양액 모두 retinol을 첨가한 결과 배반포로의 발달율에 있어서 각 처리구간의 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지 체외 성숙 배양액에 5 uM의 retinol의 첨가는 발달율과 세포수에 있어서 유의적으로(p<0.05) 효과적이었으며 10uM에서는 유해한 결과를 나타내었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.119-126
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• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

• 농업과학연구
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• 제34권1호
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• pp.19-35
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• 2007

본 연구는 돼지 난포란의 체외배양액과 배발달배양액에 성장인자인 EGF와 IGF-I을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가배양함으로서 돼지 난포란의 체외성숙과 체외배발달에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 돼지 난포란을 체외성숙배양액인 NCSU-23 배양액에 EGF와 IGF-I을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가배양하여 성숙을 유기한 다음, 체외수정을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률, 정자침투율, 웅성전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균침입정자수에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 2. 체외수정을 실시한 후, 배발달배양액인 NCSU-23에 7일간 배양한 결과, 배반포형성률은 EGF첨가군이 각각 $11.2{\pm}1.5%$, $15.0{\pm}0.8%$, $16.8{\pm}2.8%$ 및 $21.4{\pm}2.0%$로서 10 ng/ml의 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈으며, IGF-I첨가군도 $10.7{\pm}1.4%$, $12.8{\pm}2.0%$, $16.0{\pm}2.5%$ 및 $21.9{\pm}2.4%$로서 10 ng/ml의 첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈다. 또한, 총세포수에 있어서도 EGF첨가군이 $22.8{\pm}3.7$개, $25.7{\pm}5.5$개, $26.0{\pm}4.2$개 및 $35.1{\pm}4.7$개, IGF-I첨가군은 $21.5{\pm}3.7$개, $25.2{\pm}2.8$개, $26.2{\pm}2.9$개 및 $33.2{\pm}3.6$개로서 각각 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 3. 돼지 난포란을 체외성숙 기본배양액인 함유된 NCSU-23 배양액에 44시간동안 체외성숙을 유기한 다음, 체외 수정용배양액인 mTBM에 정자와 같이 6시간동안 공배양함으로서 체외수정을 유기한 후, 배발달배양액인 NCSU-23에 EGF와 IGF-I을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가하여 7일간 배양한 결과, 배반포기 도달률은 EGF첨가군에서 각각 $14.0{\pm}1.7$개, $16.2{\pm}1.4$개, $16.9{\pm}1.2$, $23.1{\pm}1.6$개로서 10 ng/ml 첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈고, IGF-I첨가군도 각각 $13.6{\pm}1.7$개, $15.7{\pm}4.5$개, $16.0{\pm}0.2$개 및 $25.0{\pm}0.8$개로 10 ng/ml군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈으며, 총세포수에 있어서는 EGF첨가군이 각각 $21.8{\pm}2.9$개, $25.2{\pm}2.8$개, $39.7{\pm}2.7$개 및 $46.2{\pm}3.6$개로 10 ng/ml첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈고, IGF-I첨가군도 $20.7{\pm}2.9$개, $26.2{\pm}2.9$개, $24.6{\pm}2.4$개 및 $46.1{\pm}3.5$개로 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, EGF와 IGF-I은 돼지 난포란의 체외성숙과 배발달과정에 영향을 미치며 특히, 10 ng/ml의 농도에서 효과적인 것으로 조사되었다.