주요 계란 난백 단백질과 그 가수분해물은 일부 금속 킬레이트 특성을 갖는 기능성 식품 성분으로 알려져 있다. 식이 oxalate를 제거하기 위해 계란 난백 단백질과 그 가수분해물을 이용할 경우 신장 결석을 예방하는데 도움이 될 것이다. 본 연구의 목적은 계란 난백 단백질인 ovalbumin, ovomucin, ovotransferrin과 이 단백질들의 효소처리를 통해 얻은 가수분해물의 biogenic oxalate chelating 활성을 측정하는 것이었다. 채소 중에서 시금치를 과일 중에서 스타푸르트(starfruit)를 선택하여 HCl처리를 거쳐 옥살레이트 추출물(oxalates extract)을 제조하였다. 계란의 난백 단백질 중, ovalbumin, ovomucin, ovotransferrin를 선택하여 이들의 가수분해물과 함께 옥살레이트 추출물과 별도로 혼합하여 3℃에서 24시간 반응을 위한 배양을 시켰다. 원심분리 후 상등액을 HPLC로 분석하여 단백질과 가수분해물의 biogenic oxalate chelating 활성을 비교 분석하였다. 사용된 모든 계란 난백 단백질과 그 가수분해물은 시금치의 oxalates에 대한 biogenic oxalate chelating 활성을 보였다. 그러나열대과일인 starfruit의 oxalates에 대한 킬레이트 활성에서는ovalbumin, hydrolyzed ovalbumin, ovomucin만이 활성을 보였다. 전반적으로, hydrolyzed ovalbumin은 시금치와 스타프루트 모두에서 oxalates chelating 효과가 가장 좋았다. 따라서 계란의 난백 단백질과 그 가수분해물의 옥살산 킬레이트 활성이 있었으며, 식이 옥살산에 대한 영양 개선을 위한 소재로 개발 가능성이 있다. 그러나, 다른 과일과 야채에 대한 옥살레이트 킬레이트 활성과 특정 생체 내 조건에서의 계란 단백질의 옥살레이트 킬레이팅 효과를 검증하기 위한 추가 연구가 필요하다.
난백에 있는 40여 가지의 단백질의 기능적 특성에 대한 연구가 폭 넓게 진행되고 있지만, 그 특성이 모두 확인되지 않았다. 난백에서 순수하면서 변성되지 않은 단백질을 분리하는 방법을 연구하기 위해 본 연구에서는 난백 중 함량이 많은 lysozyme, ovotransferrin, ovalbumin을 분리했다. 난백에서 단백질을 다른 분리 방법보다 선택적으로 분리가 가능한 이온 교환 크로마토그래피를 이용했다. 그리고 분리된 단백질을 동정하기 위해서 Reversed-phase HPLC (RP-HPLC)를 사용했다. 이온 교환 크로마토그래피에서 HI Trap ion exchange cartridge (GE Healthcare, USA)를 사용했고, 그 중에서 양이온 교환 수지 SP (완충용액 pH 8.0, pH 5.2)와 음이온 교환 수지 Q (완충용액 pH 8.0)로 난백 단백질을 분리하였다. 분리한 난백 단백질들의 동정용 RP-HPLC에서는 C18 컬럼(Phenomenex, USA)을 사용했고 등용매 용리에서 이동상으로 acetonitrile (ACN)/distilled water (DW)/trifluoroacetic acid (TFA)의 부피비를 50/50/0.1로 사용했다. 이온 교환 크로마토그래피에 의해 각 단계에서 분리된 용출용액을 RP-HPLC으로 분석한 크로마토그램과 표준시료의 크로마토그램의 체류시간을 비교하여 난백에 포함된 ovotransferrin, ovalbumin, lysozyme이 순차적으로 용출됨을 알았다.
본 연구에서는 단백질 효율이 보다 높은 두부를 만들고저 함황 아미노산이 비교적 많이 함유된 것으로 알려진 난백을 두유에 각각 혼합하여 만든 혼합물에 대한 열응고성과 응고제에 대한 응고성, 성분함량 변화, 수율, 경도 및 관능평가를 실시하였다. 수분과당 및 지방 함량은 두유만으로 제조한 두부보다 난백 첨가량이 증가함에 따라 감소하였고 단백질과 회분의 함량은 난백의 양이 증가함에 따라 증가되었다. 난백의 첨가는 두유의 응고 온도를 하강시키는 효과가 있었다. 무게와 부피 및 경도는 난백의 첨가량이 증가함에 따라서 증가 되었다. $Ca^{2+}$함량은 난백첨가량에 비례하여 감소한데 반하여 $Mg^{2+},\;K^{+},\;Na^{+}$은 증가되었다. 관능평가에서 색감과 풍미는 80%까지 첨가해도 대조구에 대하여 유의차(p<0.01)가 없었으나, 조직감과 식감에서는 난백을 60%이상 첨가한 경우 평점이 낮아지는 유의차(p<0.01)를 나타냈다. 아미노산 조성은 20, 40, 60, 80%(v/v)의 난백첨가로 함황아미노산(cys+met) 함량은 0.63, 1.20, 1.76, 2.36배의 강화효과를 나타냈다.
전량여과(dead-end filtration)를 사용하여 계란 난백용액으로부터 라이소자임 효소의 분리정제에 대한 연구를 수행하였다. 전량여과 시 사용된 한외여과 막의 분획분자량과 난백용액의 pH 변화에 따른 라이소자임의 난백에 존재하는 다른 종류의 단백질인 오발부민과 콘알부민에 대한 막을 통한 투과선택도(permselectivity)를 측정하여 투과선택도가 가장 큰 값을 나타내는 전량여과의 최적 운전조건을 결정하였다. 이 결과 난백용액으로 라이소자임을 효과적으로 투과 분리시키기 위한 최적 운전조건은 한외여과 막의 분획분자량 30 kDa, 난백용액의 pH 11이었다. 최적 운전조건에서 난백 내 총 단백질에 대한 라이소자임의 투과선택도가 약 83의 가장 큰 값을 나타내었다.
난백 lysozyme은 박테리아 세포벽을 선택적으로 분해하므로 식품 가공 및 저장용 천연 식품보존제로서의 이용 가치가 높다. 농도(0.25, 0.5, 1.0%, w/v)를 달리한 난백 용액을 예비여과하여 얻은 여액(PFS)과 PFS를 $35^{\circ}C$에서 한외여과하여 얻은 여액(PMS)의 단백질 농도와 lysozyme 농도를 측정하고 비활성도와 purification factor를 계산하여 최적 분리 농도를 결정하였다. 난백 용액의 각 단계별 lysozyme의 분리 정제도를 겔 크로마토그래피와 전기영동으로 확인하였으며, PM30 막에 대한 난백 단백질의 막 침착도는 SEM으로 관찰하였다. 예비여과와 한외여과 단계를 거치면서 lysozyme 이외의 비효소성 단백질은 99% 이상이 제거되었다. 비활성도는 0.25% PMS>0.50% PMS>1.0% PMS 순이었으며 PFS에 비해 PMS의 비활성도는 한외여과 단계를 거치면서 최저 18배에서 최고 31배까지 증가하였으므로, 비활성도와 purification factor가 가장 높은 0.25% 난백 용액을 최적 농도로 결정하였다. 난백 용액(0.25%, w/v)의 겔투과 크로마토그래피 결과 비효소 획분은 대부분 ovalbumin으로 판명되었으며, 전기영동 결과 PMS내에는 고순도의 lysozyme이 존재하였다. 분자량이 큰 단백질들이 $0.9{\mu}m$의 두께로 한외여과 막 표면에 침착되었으나, SEM 관찰 결과 이들 침착 단백질의 대부분은 0.1 N NaOH로 세척시 제거되는 것으로 나타났다. 따라서, polysulfone계의 PM30 막을 사용한 한외여과 공정이 고순도의 lysozyme만을 선택적으로 분리하는데 매우 효과적이었다.
본 연구는 알레르기 저감화 식품을 개발하기 위한 실용화 방법의 일환으로 실시되었다. 계란으로부터 난백을 분리하여 감마선을 10 및 20 kGy로 조사한 후 케이크를 만들어 알러지원성을 측정하였다. 감마선 조사된 난백으로 만든 케이크에서 추출된 단백질은 전기영동을 통해 확인하였으며 각 시료에 대한 알러지원성은 계란 알레르기가 있는 환자의 혈청을 사용하여 측정한 결과, 난백에 대한 조사 선량이 증가할수록 알러지원성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 볼 때, 감마선 조사된 난백으로 만든 케이크는 대조구에 비해 알러지원성을 감소시킬 수 있었으며 방사선 조사를 통해 알레르기가 저감화된 식품을 개발할 수 있을 것으로 보인다.
고선량 감마선 조사에 의한 계란의 저장 중 품질 변화를 측정하기 위해 신선란을 $^{60}Co$를 이용하여 조사선량을 0, 1, 5, 10, 30 kGy로 하여 조사한 후 30일간 저장 실험을 수행하였다. 조사된 계란의 품질 변화는 난황계수, 난황 색깔, 난백 pH, 난백 점도, 계란 중량, 난백 단백질의 SDS-PAGE 패턴, circular dichroism(CD), fluorescence spectroscopy 등을 측정함으로써 살펴보았다. 저장기간 중 난황계수는 감마선 조사된 계란과 대조구 모두 감소하는 경향을 보였는데 선량이 증가할수록 난황계수는 감소하였고 10 kGy와 30 kGy 등 고선량으로 조사된 계란에서 난황계수가 일시적으로 증가하는 현상을 보였다. 난황 색깔은 선량이 증가함에 따라 밝은 노란색을 나타냈으나 저장 기간 동안 큰 차이는 나타나지 않았다. 난백 점도는 선량이 증가할수록 감소하였고 저장 중 점도가 감소하는 현상을 보였으며 조사된 계란의 난백 pH가 대조구에 비해 높았고 저장 중 pH는 증가를 보였다. 저장 중 난중 감소율은 증가하였고 선량별 뚜렷한 차이는 보이지 않았다. 난백 단백질의 SDS-PAGE 패턴은 조사 선량이 증가할수록 단백질의 변화가 켰는데 10 kGy 이상 고선량 조사에서는 저분자화 뿐만 아니라 고분자화 패턴도 보였다. CD와 fluorescence spectroscopy 결과 또한 감마선조사에 의한 단백질의 2차, 3차구조 변화를 보였다. 본 연구의 결과는 계란의 감마선조사에 있어 품질 유지를 위해서는 선량 범위에 있어 보다 신중을 기해야 한다는 것을 시사한다.
난백단백질의 농도와 당류의 첨가 수준이 난백의 열감수성에 미치는 영향을 검토하기 위하며 가열처리.($60^{\circ}C$, 5분간) 전후 난백의 기능성을 측정하였으며 그 결과는 다음과 같다. 난백단백질의 농도 8.3%까지는 가열처리 전후 난백의 탁도가 감소하였으나 희석됨에 따라 증가하다가 3.32% 이하에서는 다시 감소하였다. 가열처리 전후 난백의 기포력은 단백질 농도 8.3%에서 가장 높았으며 희석됨에 따라 점차 감소하였고 기포안정성은 단백질 농도가 희석됨에 따라 점차 저하하였다. 난백에 sucrose를 첨가할 경우 탁도의 변화가 없었으나 가열처리의 경우에는 sucrose의 첨가량에 따라 점차 감소하였다. 기포력은 sucrose 5%이상 첨가 시 감소하였으며 가열처리의 경우에는 sucrose 2.5%이상 첨가 시 점차 감소하였다. 기포안정성은 sucrose를 5%이상 진가할 경우 점차 증가하였으나 가열처리한 경우에는 sucrose의 첨가량에 따라 증가하였다. Glucose의 첨가량에 따라서는 탁도가 높아졌으며 가열처리 시에는 변화가 없었다. 기포력은 Glucose의 첨가량에 따라 점차 감소하였으며 가열처리의 경우에는 5%이상 첨가 시 다소 감소하였다. 기포안정성은 가열처리 전후 glucose의 첨가량에 따라 증가되었으며 sucrose의 첨가시 보다 크게 증가되었다.
난백단백질의 농도와 당류의 첨가수준이 난백의 열안정성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 가열처리($120^{\circ}C$, 30분 또는 $90^{\circ}C$, 30분) 전후 난백겔의 조직감 및 색택을 측정하였으며 그 결과는 다음과 같다. 난백단백질의 농도가 낮아짐에 따라 난백겔의 경도는 열처리 조건에 상관없이 급격히 덜어졌으며 명도와 황색도는 점차 감소하였다. 응집성은 단백질 농도가 $8.3^{\circ}C$ 이하로 희석됨에 따라 증가하기 시작하였다. Sucrose 2.5%의 첨가로 난백겔의 경도가 다소 증가하였으나 그 이상 원가로 점차 저하하였으며 sucrose의 첨가로 응집성은 다소 저하하였다. Glucose의 첨가에 의해 고온처리 시 난백의 응집성은 다소 증진되었으나 명도가 감소하고 황색도는 저온처리의 경우에도 고온처리와 같이 높아졌다.
난백과 혈장, 대두단백질은 겔화식품의 겔강화와 단백질 보강의 목적으로 다양하게 사용되고 있으며, 이 때 첨가단백질의 겔화 특성은 가장 중요한 피능적 특성중 하나이다. 이러한 겔화에는 단백질의 종류, 가열온도와 시간, 염의 유무, pH등의 환경이 복합적으로 작용하여, 소수성 상호작용, 공유결합, 이온결합, S-S결합 및 수화력 등이 겔을 형성한다. 단백질의 겔화에 미치는 변수에 대한 많은 연구가 이루어졌지만 단백질의 겔화 특성에 있어 가장 많은 구성비율을 차지하는 수분과 수화력에 관한 연구는 미미한 실정이다. (중략)
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[게시일 2004년 10월 1일]
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