• 생명과학회지
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• 제25권4호
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• pp.385-389
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• 2015

선행연구에서 카스파제-3 효소가 DEVD 기질을 완전히 절단하는 반면 IETD 기질은 DEVD의 약 50%정도만을 부분적으로 분해한다는 사실을 보고하였다. 본 연구에서는 정제된 폴리-단백질이 카스파제-3 단백질 분해효소의 기질에 따른 차별적인 분해활성에 의해 프로세싱 되는 양상을 분석하였다. 모델 단백질로서 GST, MBP, RFP 세 종류의 단백질을 DEVD 및 IETD 펩타이드로 연결시킨 폴리-단백질을 제작하였으며, 폴리-단백질은C-말단에 6개의 히스티딘 태그가 결합되도록 클로닝 되었다. IMAC 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통해 분자량이 약 93 kDa으로 나타났으며, 카스파제-3 효소의 처리에 의해 각각 MBP:RFP, MBP 그리고 GST 3종류의 단백질 절편으로 절단 및 분리되었다. 이 연구를 통해 단백질 분해효소와 기질 간의 반응성의 차이를 이용하여 폴리-단백질을 정량적으로 프로세싱 할 수 있다는 예를 보여주었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제41권1호
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• pp.47-52
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• 1998

3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) 환원효소는 식물의 병원균 방어물질 (phytoalexin), 광합성 색소 (the phytol of chlorophyll), 성장 호르몬 (abscisic acid와 gibberellin 등) 및 스테롤 (phytosterol) 등의 생합성에 관여하는 주효소이다. 암조건 하에서 발아 후 4일째의 벼 유묘 microsome을 재료로 비이온성 detergent 인 Brij W-1 (final 0.4%)을 사용하여 가용화 시킨 후, DEAE-Sephadex A-50 크로마토그래피 칼럼과 hexaneagarose를 matrix로 기질인 HMG-CoA를 결합시켜 제조한 친화성 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 세포막 결합효소인 HMG-CoA 환원효소를 정제하였다. 정제된 HMG-CoA 환원효소의 최종 회수율은 7.14% 였고, 분자량은 10% SDS-PAGE에서 55 kDa이였다 HMG-CoA 환원효소의 최적 반응 온도는 $37^{\circ}C$, 최적 반응 pH는 6.9였고, 기질인 HMG- CoA에 대한 HMG-CoA 환원효소의 $K_m$ 및 $V_{max}$ 값은 $180\;{\mu}M$과 107 pmol/mg, 수소공여체인 NADPH에 대한 $K_m$과 $V_{max}$값은 $810\;{\mu}M$과 32.1 pmol/min/mg이였다.

• 한국수산과학회지
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• 제31권5호
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• pp.637-644
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• 1998

우리나라 근해에 많이 분포하고 있는 말똥성게 (sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus)의 내장으로부터 Triton X-100을 이용하여 $\beta$-galactosidase를 추출하고, $40\~80\%$ (w/v) $(NH_4)_2SO_4$, DEAE-Sephadex A-25 및 CM-Cellulose 이온교환 크로마토그래피, Con A-Sepha-rose 4B 친화성 크로마토그래피를 사용하여 분리, 정제하여 그 생화학적 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 정제된 $\beta$-galactosidase는 단일의 단백질로 이루어진 효소로 판명되었고, 효소의 정제도는 조효소에 비해 384.6배 증가하였고, 수율은 $1.26\%$이었다. 정제효소의 최적 pH와 온도는 각각 3.0 및 $50^{\circ}C$ 이었다. 효소의 활성은 $Ba^{2+}$와 같은 금속이온에 의해 촉진되었고, $Hg^{2+},\;Sn^{2+}$ 및 DFP에 의해 현저하게 저하되었으며, 당인 galactose 와 lactose에 의해 저하되어 기질 저해 효과가 나타남을 알 수 있었다. 효소의 분자량은 SDS-PAG 전기이동과 Sephadex G-150 겔여과를 실시한 결과 97 kDa로 나타났다. 합성기질인 PNPG를 사용하여 효소의 속도론적 상수를 측정한 결과 $K_m$은 15.0mM, $V_{max}$는 $\mu$mole/min$\cdot$mg$\cdot$protein으로 나타났다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권2호
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• pp.130-139
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• 2016

지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 지질을 가수분해하는 활성이 높은 미생물을 선발하였으며, 동정하여 Aeromonas hydrophila PL43으로 명명하였다. A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제는 황산암모늄 침전, DEAE-sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose S-300HR 겔 크로마토그래피 단계로 수행하였으며 최종적으로 정제한 지질분해 효소는 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)를 기질로 사용했을 때, 84.5배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 3.7%이었다. p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 기질로 사용했을 때에는 56.6배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 2.5%이었다. SDS-PAGE를 수행한 결과, A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해효소의 분자량은 약 74 kDa으로 추정되었다. 지질분해 효소의 pH에 대한 영향은 pNPB와 pNPP 기질에서 pH 8.0에서 최대활성이 보였고 pH 7.0−10.0에서 안정하였다. pNPB를 기질로 사용한 경우에는 50℃에서 pNPP를 기질로 사용한 경우는 60℃에서 최대 활성을 나타냈으며, 정제한 지질분해 효소는 20−60℃에서 안정성을 나타내었다. 정제한 지질분해효소는 금속이온 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺에 의해서 효소활성이 억제되었으며, EDTA의 metal chelating에 의해 활성이 회복되었다. Inhibitor에 의한 저해는 효소 활성부위의 serine 잔기와 결합하여 효소 활성을 억제하는 PMSF에서 가장 우수하였으며 효소 활성부위의 aspatyl 잔기에 결합하여 효소활성을 억제하는 pepstatin A는 농도가 높아짐에 따라 효소활성을 저해하였다. 따라서 정제한 지질분해 효소는 활성부위에 serine 잔기와 aspartyl 잔기가 있는 것으로 사료되었다. 정제한 지질분해 효소의 K_m 값과 V_max 값은 pNPB를 기질로 사용 했을 때 K_m 값과 V_max 값은 1.07 mM과 7.27 mM/min이고, 기질이 pNPP일 때 K_m 값과 V_max 값은 1.43 mM 과 2.72 mM/min이었다.

• 생명과학회지
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• 제30권2호
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• pp.137-146
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• 2020

식물에서 Ca²⁺는 세포의 중요한 2차 신호 전달 분자 중 하나이다. Ca²⁺ 및 인산화 효소의 센서 단백질인 칼슘-의존성 단백질 카이네즈(CDPKs)는 식물 세포에서 가장 풍부한 세린/트레오닌 키나아제이다. 이들은 다양한 자극에 대한 신호를 변환하여 식물에서 특정 반응을 일으킨다. 벼에는 31개의 CDPK 유전자 족이 확인되었다. 그들은 주로 식물의 생장과 발달에 관여하며 다양한 스트레스 조건에 반응하여 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 CDPK 단백질의 생화학적 특성에 대해서는 알려진 바가 별로 없다. 이 연구에서는 벼의 CDPK 중 하나인 OsCPK11을 부분 정제하여 그 생화학적 특성을 조사하고자 하였다. 벼 유식물에서 3단계 칼럼 크로마토그래피 과정을 거쳐 부분 정제된 OsCPK11을 얻었다. 정제 과정에는 DEAE를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, Phenyl-Sepharose를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 Sephacryl-200HR를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 포함하였다. 부분 정제된 OsCPK11은 분자량이 54kDa이며 소수성 수지와 강한 소수성 상호작용을 보였다. 부분 정제된 OsCPK11으로 in vitro kinase assay를 실시한 결과, OsCPK11은 Ca²⁺-의존성 자가인산화 활성을 가짐을 보여 주었다. OsCPK11은 histone III-S를 인산화 하였으며, 카이네즈 활성의 최적 pH는 7.5-8.0이었다. Native OsCPK11은 이전에 연구된 재조합 OsCPK11과 몇 가지 생화학적 특징을 공유하였는데, 둘 다 Ca²⁺-의존성 자가인산화 활성을 나타냈다. 또한, 둘 모두 카이네즈 활성을 위한 기질로서 histone III-S를 선호하였으며, Ca²⁺ 의존성을 보여 주었다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 춘계학술발표대회
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• pp.485-488
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• 2000

Thiobacillus thioparus TK-m에서 메칠머캅탄(MM) 가스를 기질로 메칠머캅탄 산화효소(MMO)를 유도할 수 있었으며 DEAE-Sephacel과 Superose 12 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때 얻어진 각 효소의 비활성은 각각 374과 1240.8 units/mg-protein이었으며 효소의 최적 온도는 $55\;^{circ}C$였다. 상기 정제된 효소액은 SDS-PAGE상에서 66.1 kDa의 분자량을 가지며 20 mM $(NH_4)_2SO_4$ 혹은 200 mM NaCl의 첨가에 대해 최대 활성을 보였다. 글리세린, 에탄올, 아세톤의 첨가에 대해 효소활성은 부분적으로 불활성화되었으며 메탄올에 대해서는 저해받지 않았다. Purpald 발색법을 이용한 흡광도의 변화는 구강내 존재하는 MM 가스로부터 생성될 수 있는 수 십 nmol의 범위의 포름알데하이드에 대해 눈으로 인지가능한 발색시스템에 사용할 수 있음을 확인하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제27권2호
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• pp.266-269
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• 1995

알코올 함량을 보다 신속하고 정확하게 측정하고자, 알코올 센서를 사용하였다. Alcohol oxidase를 glutaraldehyde로 nylon net에 고정화시킨 다음 산소전극에 연결하여 기질과의 반응에서 소모되는 용존산소 소비량의 변화를 용존산소측정기로 측정하여 알코올을 정량하였다. 알코올 센서의 최적조건에서 시판되는 각종 주류를 측정해 본 결과, 각각 맥주는 $4{\sim}5%$, 저알코올성 음료는 0.71%, 포도주는 10.06%, 청주는 16.12%, 소주는 25.71%, 탁주는 6.18%로 정량되었으며, 이는 가스 크로마토그래피로 측정한 값과 좋은 상관관계를 가졌다.

• KSBB Journal
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• 제9권5호
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• pp.499-505
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• 1994

Bacillus macerans cyclodextrin glucanotrans­f ferase(CGTase)를 전분흡착법과 DEAE--cellulose 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 효소의 분자량 은 67,000이였고 monomer였다. 정제된 효소는 전 분을${\alpha}$-, ${\beta}$-, ${\gamma}$-CD 로 전환시켰으며, CD생성비율은 각각 1 : 1.68: 0.32였다. ${\alpha}$-CD와 D-glucose의 coupling반응 초기에는 maltohexose가 주로 생성되었고, 그 후에 다른 oligosaccharide들이 생성되었다 .. a­C CD의 가수분해반응 초기에는 주로 maltotetrose가 생성되였고 그 이후에는 소량의 다른 이Igosa­C ccharide들이 생성되었다. 정제된 효소의 좋은 기질인 maltotriose 로부터 maltosyl 이나 D-glucopy ranosyl group이 전이될 수 있는데, 본 연구에서는 D정lucosyl transfer가 우세하였다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제17권3호
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• pp.205-210
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• 1988

돼지감자로부터 inulase를 분리한 다음 황산 암모늄침전, Sephadex G-100 겔 투과 및 DEAE-cellulose 크로마토그래피를 통하여 정제하여 최종적으로 회수율 42%의 6,470배 정제된 효소를 얻었다. 이 효소의 분자량은 57,000으로서 하나의 폴리펩티드로 구성되어 있었다. 이 효소의 최적 pH와 최적온도는pH5.0과 $33^{\circ}C$이었으며 몇 가지의 기질중 inulin에 대해서만 특이적으로 작용하였고 이에 대한 Km값은 20mM, Vmax는 943unit/mg-단백질이었다. 또한 이 효소는 metalloenzyme이 아니며 $Mg^{2+},Ca^{2+},\;Hg^{2+}$등의 금속 이온에 의해 그 작용이 완전히 저해되었다.

• 생명과학회지
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• 제25권9호
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• pp.1021-1026
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• 2015

Invertase (β-D-fructosfuranosidase, EC 3.2.1.26)는 설탕을 포도당과 과당으로 가수분해하는 반응을 촉매한다. 3종류의 invertases [액포(수용성 산), 세포질(수용성 알칼리) 및 세포벽 결합]가 식물에서 연구되어 왔다. 우리는 순차적인 ammonium sulfate 침전, 이온교환크로마토그래피, 흡수크로마토그래피, Green-19 친화크로마토그래피 과정을 통해 완두콩(Pisum sativum L.) 발아체로부터 중성 invertase의 세포막 연결 isoform을 430배 순수 분리하였다. 분리된 세포막과 결합 된insoluble invertase (IN-INV)는 최적 pH는 중성에서 알칼리 사이(pH 6.8-7.5)로 나타났다. 이 효소는 Tris 뿐만 아니라 Hg²⁺ and Cu²⁺와 같은 중금속에 의해 저해되었다. IN-INV 의 K_m과 V_max 값은 각각 12.95 mM과 2.98 U/min으로 측정되었다. IN-INV는 기질로써 과당뿐만 아니라 라피노오스와 반응하기 때문에 진정한 β-fructofuranosidase로 판명되었다. IN-INV의 분자량 20 kDa이었다. 위 결과로 볼 때 GA 영향으로 급속히 자라는 발아체에서 단백질이 분리되었는데 특징적으로 invertase였다.