농업현장에서 활용되는 농업용미생물의 효능을 평가하고 현장실용화를 제고할 목적으로 본 시험을 수행하였다. 8개 지자체를 대상으로 친환경농업 특성화 지원사업 현황을 조사하고, 지자체별 미생물 활용수준을 평가하였으며, 각 지자체별로 활용되는 미생물을 수집하여 항균활성, siderophore 생성, IAA 생성, 질소고정, 인산가용화 능력 및 작물생육에 미치는 영향을 분석하였다. 지자체에서 활용하는 미생물은 주로 유산균, 고초균, Bacillus속 세균, 광합성균, 효모 및 EM 등으로 몇가지 종류의 미생물을 활요하는 것으로 조사되었고, 배양을 위한 배지는 대부분 균주를 개발한 대학 또는 산업체에서 공급받는 것으로 나타났으며, 배양기술 측면에서 볼 때 단순 배양 보급하는 지자체가 2개소, 산-학-연간 공급네트워크 및 대량배양체계를 구축하여 미생물을 활용하는 지자체가 7개소, 미생물 대량배양체계를 구축하고 병해충 관리연구를 수행하는 지자체가 1개소 그리고 미생물 선발, 특성검정 및 효과 평가 등 개발 및 응용을 추진하는 지자체가 1개소인 것으로 나타나 지자체에 따라 활용기술 수준은 큰 차이를 보였다. 지자체 공급 농업미생물의 항균활성을 조사한 결과, 고초균, 효모, 유산균, 광합성균, Bacillus속 세균 모두에서 균주에 따라 항균활성을 보였는데, 특히 Bacillus 속 세균이 높은 빈도로 황균활성을 보이는 것으로 나타났다. 철 킬레이트 능력 (Siderophore 형성능)에 있어서는 5개 광합성 균주 중 1균주가, 5종의 효모 중 1균주만이 활성을 보인 반면, Bacillus속 세균(고초균 포함)의 경우에는 11개 균주 모두 활성을 보였다. 작물 생육과 밀접한 관계가 있는 IAA(Indole acetic acid)의 생성능에 있어서는 광합성균이 5균주 중 4균주가 활성을 보여 비교적 생성능이 높은 것으로 나타났으며, Bacillus 속 세균의 경우에는 11균주 중 8개 균주가 활성을 보여 광합성균 다음으로 높은 반도를 나타냈다. 효모의 경우에는 5균주 중 1개 균주가 IAA를 생성하는 것으로 나타났다. 질소고정능에 있어서는 광합성균은 5균주 중 3균주, Bacillus 속세균 11균주 중 6균주가, 효모는 5균중 1균주가 활성을 보인 반면, 유산균 중에는 단 한 균주도 질소 고정능을 보이지 않았다. 연작재배에 따라 토양 내에 축적되는 인산의 가용화능을 분석한 결과, 수집한 대부분의 유산균은 높은 활성을 보인 반면 기타 미생물은 인산가용화능이 거의 없는 것으로 나타났다. 결론적으로 Bacillus 속 세균은 항균활성이 높고, 작물생육과 밀접한 IAA 생성 및 질소고정능력을 보유 하고 있는 것으로 나타나 친환경 작물재배시 병 발생을 줄이고 작물생장을 촉진할 수 있는 미생물로 평가되었다. 농업현장에서 기능성 및 효능을 고려하여 미생물을 잘 활용하면 병 발생 관리 및 생산성 향상에 도움이 되리라 판단된다.
고추재배시 발생하는 탄저병을 해결할 수 있는 방안을 찾고 농업용 유용미생물을 활용하여 농약사용량을 경감시키며 고추의 수량 및 기능성 물질 증가에도 기여할 수 있는 노지재배법을 규명하고자 실시한 본 실험의 결과는 다음과 같다. 공시한 두 품종간 경직경 및 분지수는 유의한 차이를 나타냈으며, 균처리간에는 경직경, 주경장, 분지수에서 유의한 차이를 보였다. 품종간 비교를 보면 '무한질주'보다는 '대통' 품종의 초장 및 초폭이 길고 분지수가 많았다. 생고추 수량은 광합성균 처리구가 53.1kg/10a로 가장 높았고, 다음으로 고초균이 34.9kg/10a을 나타내었으며 관행구는 18.5kg/10a로 가장 낮았다. 탄저병 발생율은 유산균 처리구가 14개로 가장 높았고 다음으로 관행구가 13개였으며 광합성균 처리구가 6개로 가장 낮았다. 품종별 평균수량을 보면 '대통'은 33.8kg/10a로 '무한질주'의 31.2kg/10a에 비해 약 8% 높았다. 붉은 생고추 0.5g 속에 들어있는 무기물 함량은 칼륨과 나트륨 성분을 제외하고는 균처리간 고도의 유의적인 차이를 나타냈다. 균 처리별 무기물 함량을 살펴보면 총 질소함량은 '무한질주'에서는 유산균 처리구가 1.81%로 가장 높게 나타났다. 인산($P_2O_5$) 함량은 두 품종 모두 고초균 처리구가 0.72%로 가장 높았다. 망간(Mn) 함량도 균처리간, 품종간 고도의 유의적 차이가 인정되었다. '무한질주'의 망간(Mn) 평균함량은 30.86ppm이었고, '대통' 품종은 38.55ppm을 함유하고 있어 '무한질주'보다 '대통' 품종의 망간 함유량이 약 25% 높았다. Carotenoid 총 함량은 '무한질주' 및 '대통' 모두에서 고초균 처리구가 각각 $371.6{\mu}g/g$, $322.2{\mu}g/g$으로 가장 높게 나타났으며 관행구의 평균 carotenoid 함량 $209.24{\mu}g/g$에 비해 78~54%나 높게 나타났다.
본 연구에서는 증자 콩에 증식하여 부패취를 유발하는 오염균인 야생고초균의 생육을 억제하고 정상발효를 유도하기위해 젖산, 과산화수소 등과 항균성 물질인 bacteriocin을 생성하는 유산균으로 1단 발효를 실시한 후 장류용 황국균을 접종하여 2단 발효 후 다시 고초균으로 3단 발효시켜 황국균과 고초균의 protease, peptidase를 효과적으로 사용함으로서 단백질 분해율이 높아 아미노산 생성량이 많은 기호성 높은 고품질의 메주를 제조하였다. 3단 발효법으로 제조된 메주의 수분함량과 pH를 측정한 결과 각각 54.0 %와 pH 7.0였고 제조된 메주를 30일간 20% 염수로 용출하여 총 유리 아미노산함량을 비교한 결과 3단 발효법으로 제조된 메주구가 대조구에 비해 약 $3{\sim}5$배 높게 나타났다. 특히 장류의 맛을 좌우하는 감칠 맛 성분인 glutamic acid와 aspartic acid의 함량은 대조구에 비해 매우 높아 메주를 원료로 제조하는 장류의 품질을 향상시킬 수 있으며 유리아미노산이 용출되는 시간이 대조구보다 짧아 장류 제조시 발효기간을 1/3정도로 단축시킬 수 있다.
황칠나무 추출물의 순차적 복합발효를 통한 복합 기능성 물질들을 강화시킨 발효소재를 개발하였다. 황칠 추출물에 MSG와 glucose를 첨가한 후 1차 B. subtillis HA 발효를 통해 γ-PGA와 단백질 분해효소를 생성시켰다. 이후 skim milk와 glucose, yeast extract를 추가적으로 첨가하여 30℃에서 L. plantarum KS2020에 의한 2차 복합 발효를 통해서 기능성 물질인 GABA를 생산하였다. 황칠 추출물의 고초균 발효에서 생성된 점질물 및 점조도은 발효 2일 4.21±0.04 Pa·s, 4.1%±0.48%로 높은 점조도 값과 점질물을 함량을 보였다. pH 및 산도는 각각 8.9±0.01, 0.00±0.00이었으며 생균수는 7.27 log CFU/mL에서 발효 2일에 9.50 log CFU/mL로 높은 생균수를 보였다. 순차적 복합 발효가 진행되면서 고초균의 생균수는 4.30 log CFU/mL로 크게 감소하였으며 젖산균은 9.12 log CFU/mL로 증가하였다. Protease 활성 및 tyrosine 함량은 각각 0.8 unit/g, 57 mg%로 측정되었다. 이후 연속적 복합 발효 과정에서 발효 5일 차 106 mg% 정도로 증가되었으며, SDS-PAGE를 이용하여 casein 단백질이 분해된 것을 확인하였다. GABA 정성분석 결과 skim milk 5%만을 첨가한 조건을 제외하고 glucose, yeast extract가 추가로 첨가된 모든 조건에서 전구물질 MSG가 소진되면서 GABA로 전환되었다. 이중 최적 조건을 골라 정량분석을 진행하였으며 18.29 mg/mL의 GABA 함량을 나타내었다. 최종 황칠 복합 발효물은 γ-PGA, peptides, 고농도 GABA를 함유한 발효소재로써 다양한 식품의 원료 활용이 기대된다.
청국장은 삶은 콩을 고초균으로 불리는 Bacillus subtilis를 이용하여 발효시킨 전통조미식품으로, 최근 혈전용해효소의 함유뿐만 아니라 항돌연변이, 항고혈압, 항암효과 등이 검증되어 기능성 식품으로서 새로운 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, 청국장의 독특한 불쾌취는 특히 젊은 세대의 섭취 기피 원인이 되고 있고, 찌개 형태의 단순한 조리법은 이용 방법면에서 한계를 가지고 있다. 따라서 영양이 풍부하고 우수한 생리활성효과를 가진 청국장의 계승 발전과 소비 진작을 위하여 청국장의 기호성, 편의성 등을 강화하고 청국장의 제조법을 간편화하는 연구가 필요한 실정이다.
유기 염소계 소독제인 삼염화이소시아눌산(trichloroisocyanuric acid)에 의한 다양한 미생물의 사멸특성을 규명하기 위하여, 대장균, 고초균, 포도상구균, 레지오넬라균, 수도모나스균 등을 각각 증류수에 부유시킨 후, 접촉시간과 소독제의 농도를 변화시키면서 사멸률을 측정하였다. 삼염화이소시아눌산 8 ppm 수용액 하에서 미생물 99%의 사멸률에 도달하는 시간은 대장균 60초, 수도모나스균 368초, 포도상구균 372초, 고초균 506초, 레지오넬라균 812초 순으로 측정되었다. 특히 대장균 사멸률 99%에 도달하기 위한 같은 농도(8 ppm) 세 종류의 소독제 접촉시간은 삼염화이소시아눌산 60초, 단토브롬(BCDMH, Bromochlorodimethylhydantoin) 114초, 칼슘하이포(calcium hypochlorite) 7,100초 순으로, 대장균에 대한 삼염화이소시아눌산의 소독력이 가장 우수하게 측정되었다. 본 연구결과는 염소계 소독제에 의한 사멸특성이 미생물 종 특이적이며 또한 소독제의 종류, 농도, 접촉시간에 따라서 매우 다양하게 측정됨을 제시하고있다.
본 연구에서는 3가지 서로 다른 미생물을 이용하여 콩을 발효시킨 후 제품의 알레르기성 변화를 살펴보았다. 증자 후 가열 살균된 콩은 유산균(Lactococcus actis subsp. lactis) 그리고/또는 황국균(Aspergillus oryzae) 그리고/또는 고초균(Bacillus subtilis)을 이용하여 발효되었다. 콩 단백질이 발효과정에서 분해됨을 확인하였다. 발효과정 후 콩 단백질의 알레르기성과 항원성의 변화는 콩 단백 특이 다클론 항체 또는 콩에 대해 알레르기 반응을 일으키는 환자들의 혈청을 이용하여 면역반응검사법으로 확인되었다. 콩 단백질은 니아신 생성균주 L. lactis subsp. lactis IFO12007와 황국균 그리고 고초균을 이용한 3단 발효에 의해 가장 강력한 분해가 이루어졌다. 3단 발효 후 콩의 알레르기성 및 항원성도 크게 감소되었다. 본 연구에서 확인된 3단 발효법은 콩의 알레르기성을 저하시키는 강력한 방법 중의 하나이다.
다양한 미생물은 세포와 주변의 과산화를 방지하고 여분의 에너지를 보관하기 위해 ${\alpha}$-acetolactate decarboxylase(ALDC)를 이용해 아세토인을 생성한다. 아세토인은 안전한 식품 향미 개선제이기 때문에 ALDC를 이용한 아세토인 생합성에 많은 산업체가 관심을 가지고 있다. ALDC는 ${\alpha}$-acetolactate의 탈카르복실화 반응을 통해 아세토인을 생산하는 금속 의존 효소이다. 본 논문에서는 고초균 아종 spizizenii의 ALDC(bssALDC) 결정구조를 $1.7{\AA}$ 해상도에서 보고한다. bssALDC는 두 개의 ${\beta}$-sheet가 중앙부를 형성하는 ${\alpha}/{\beta}$ 구조를 가진다. bssALDC는 중앙부의 소수성 상호작용과 주변부의 친수성 상호작용을 통해 이합체를 형성한다. bssALDC는 세 개의 histidine 잔기와 세 개의 물 분자를 이용해 아연 이온에 배위결합한다. 구조와 서열의 비교 분석에 기초하여 아연 이온과 이 주변부 bssALDC 잔기들이 bssALDC의 효소 활성부위임을 제안한다.
Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is one of important growth factors for skeletal development and bone growth. In this work, BMP-7 was efficiently expressed in recombinant Bacillus subtilis. The mature BMP-7 protein indicated molecular weight of 15.4 kDa by Western blot assay and was secreted into culture medium with 0.35 ng/mL. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins were purified by using a FPLC system with an ion exchange column and a gel filtration column. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins had finally a 57.1% purity and a 36.2% purity, respectively. The purified rhBMP-7 proteins showed an intact biological activity which stimulated alkaline phophatase (ALP) activity in MC3T3-E1 cells.
The alkaline elastase is an extracellular serine protease of the alkalophilic Bacillus strain Ya-B. To increase the gene copy number and the production level of the alkaline elastase Ya-B, we designed, on the B. subtilis chromosome, a gene amplification of the 10.6 kb repeating unit containing amyE, aleE (alkaline elastase Ya-B gene) and tmrB. The aleE was inserted between amyE and tmrB, and B. subtilis APT119 strain was transformed with this amyE-aleE-tmrB-junction region fragment. As a result, we succeeded in obtaining tunicamycin-resistant (Tm$^{r}$) transformants (Tf-1, Tf-2) in which the designed gene amplification of 10.6 kb occurred in chromosome. The transformants showed high productivity of $\alpha $-amylase and alkaline elastase Ya-B. The copy number of the repeating unit (amyE-aleE-tmrB) was estimated to be 25, but plasmid vector (pUC19) was not integrated. The amplified aleE of chromosome was more stable than that of plasmid in absence of antibiotics.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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