• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제31권1호
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• pp.1-16
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• 2006

최근 진단분야에 있어서의 가장 획기적인 진보로는 향상된 진단 술식의 민감도와 특이도를 들 수 있으며 이는 다양한 면역 화학물질과 분자생물학적 시약의 활용도가 증가되고 이와 더불어 진단용 기구의 수준 향상으로 가능해진 미세 술식의 발달에 따른 결과이다. 이러한 기술의 발전은 임상검사용 검체 뿐만 아니라 DNA의 공급원으로서의 타액의 진단학적 가치를 고려하게 되었다. 본 연구는 인체의 타액에서 genomic DNA를 분리하고 이를 혈액 및 협점막 swab에서 분리한 genomic DNA와 비교 검토해 봄으로써 타액 검체의 진단학적 활용도를 살펴보고, 타액 검체의 다양한 보관 과정이 genomic DNA의 분리에 미치는 영향을 살펴보고자 시행되었으며, 또한 분리된 genomic DNA의 안정도를 살펴보고자 중합효소 연쇄반응 분석법을 이용하여 $\beta$-globin 유전자의 증폭을 시행하였다. 10명의 피검자(평균 나이: $29.9{\pm}9.8$ 세)를 대상으로 혈액, 비자극성, 자극성 전타액 및 협점막 swab을 채취한 후 이로부터 genomic DNA를 분리하였다. 여러 다양한 보관조건이 genomic DNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 건강한 20명의 피검자(평균 나이: $32.3{\pm}6.6$ 세)를 대상으로 자극성 전타액을 채취하여 실온, $4^{\circ}C$, $-20^{\circ}C$, $-70^{\circ}C$, 자연 건조 및 동결 건조 상태에서 1, 3, 5 개월 동안 보관한 후 genomic DNA를 분리, 조사하였으며, 분리된 genomic DNA의 안정도를 살펴보고자 중합효소 연쇄반응 분석법을 이용하여 989-bp의 $\beta$-globin 유전자를 증폭한 후 전기영동 검사를 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 타액으로부터 분리한 genomic DNA의 농도는 혈액의 경우에 비하여 유의하게 낮았으며(p<0.05), 타액군 간에는 유의한 차이가 없었다. 자극성 전타액과 이를 동결 건조한 검체에서 분리한 genomic DNA의 순도는 혈액의 경우에 비하여 유의하게 높았으며(p<0.05), 협점막 swab으로부터 분리한 genomic DNA 의 순도는 타액의 경우에 비하여 유의하게 낮게 나타났다(p<0.05). 2. 실온에서 보관한 타액 검체로부터 분리한 genomic DNA의 농도는 1 개월 후부터 점차적으로 감소되었으며, 3 개월과 5개월 동안 보관한 타액 검체에서는 유의하게 감소되었다(각각 p<0.05, p<0.01). DNA의 순도 또한 점차적으로 감소되어 3 개월과 5 개월 동안 보관한 타액 DNA의 순도는 신선한 타액과 1 개월 동안 보관된 타액 검체의 순도보다 낮게 나타났다(p<0.05). 3. 타액 검체를 $4^{\circ}C$와 $-20^{\circ}C$에서 보관한 후 분리한 genomic DNA의 농도는 3 개월의 보관 기간 동안 유의한 변화가 없었으나, 보관 기간 5 개월 후의 검체에서는 유의하게 감소되었다(p<0.05). 4. 타액을 $-70^{\circ}C$에서 보관한 검체와 동결 건조한 후 보관한 검체로부터 분리한 genomic DNA의 농도는 보관 기간에 따른 유의한 차이를 보이지 않았으나, 보관 후 5 개월 후의 검체에서는 DNA의 농도가 감소되는 경향을 보였다. 5. 타액을 자연 건조한 후 즉시 genomic DNA를 분리한 결과, 신선한 타액에 비하여 약 60%의 DNA를 얻을 수 있었다. 자연 건조한 후에 실온에서 보관한 타액 검체로부터 분리한 genomic DNA 농도는 보관 2 주 만에 급격하게 감소되었다(p<0.05). 6. 중합효소 연쇄반응 방법을 이용한 $\beta$-globin 유전자의 증폭은 동결 건조한 후 보관한 타액의 경우 보관 기간 5 개월까지의 모든 검체에서 가능하였으며, 보관 기간 1 개월을 기준으로 보았을 때 $-20^{\circ}C$와 $-70^{\circ}C$에서 보관한 타액의 경우 모든 검체에서, $4^{\circ}C$에서 보관한 타액의 경우 일부분의 검체에서만 증폭이 가능하였고, 실온에서 보관한 타액과 자연 건조 후 실온에서 보관한 타액의 경우는 증폭이 이루어지지 않았다.

• 대한한방종양학회지
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• 제4권1호
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• pp.37-53
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• 1998

과학기술(科學技術)의 발전(發展)에 따른 생활(生活) 및 의료(醫療) 수준의 향상(向上)에도 불구하고 산업발전(産業發展)에 따른 환경오염(環境汚染), 스트레스 증가(增加) 등 그 역기능(逆機能) 때문에 발암물질(發癌物質) 또는 자극(刺戟)에의 노출(露出) 등으로 인해서 전세계적(全世界的)으로 암(癌)으로 인(因)한 사망율(死亡率)이 증가(增加)되고 있다. 암(癌)은 현재(現在) 인류(人類)의 건강(健康)을 위협하는 주요(主要)한 질환(疾患)의 하나로, 오늘날 우리 나라에서 질환(疾患)으로 인(因)한 사망원인중(死亡原因中) 수위(首位)를 차지하고 있다. 이러한 암(癌)의 발생(發生)은 80%-90%가 환경적(環境的) 인자(因子)에 기인(起因)한다고 보고(報告)되고 있는데 앞으로 환경성(環境性) 발암물질(發癌物質)이 점차 증가(增加)됨에 따라 암환자(癌患者)의 발생(發生)도 더욱 증가(增加)될 것으로 예상(豫想)된다. 암(癌)의 서의학적(西醫學的) 치료(治療)는 주로 수술요법(手術療法), 방사선요법(放射線療法), 화학요법(化學療法) 및 면역요법(免疫療法) 등이 활용(活用)되고 있다. 이중 수술요법(手術療法)과 방사선요법(放射線療法)은 암(癌)이 전신(全身)에 전이(轉移) 증식(增殖)되기 전에 실시(實施)함으로써 효과(效果)를 거둘 수는 있으나, 암(癌)이 원발병소(原發病巢) 이외(以外)에까지 전이(轉移) 증식(增殖)되었을 경우에는 이 두가지 방법(方法)의 국소요법(局所療法)만으로서는 좋은 치료효과(治療效果)를 거두기 어렵다. 따라서 최근 항암제(抗癌劑)에 의한 화학요법(化學療法)이 다른 방법(方法)보다 유효(有效)하다고 인정(認定)이 되어 가장 많이 활용(活用)되고 있으나, 암종(癌種)에 대한 감수성차이(感受性差異), 치료후(治療後)의 부작용(副作用), 재발(再發) 및 합병증(合倂症) 등의 문제점(問題點)때문에 부작용(副作用)을 감소(減少)시키면서 항암효과(抗癌效果)를 높이는 치료법(治療法)이 계속 연구(硏究)되고 있다. 이에 1972년(年) 미국(美國) 국립암연구소(國立癌硏究所)에서 실시(實施)한 항암제(抗癌劑) 개발연구(開發硏究)에 있어서 항종양성(抗腫瘍性) Screening test에 이용(利用)된 물질중(物質中) 약 47%가 천연물질(天然物質)이었다는 사실은 주목(注目)할만 하다. 한의학적(韓醫學的) 치료법(治療法)은 최근(最近)에 변증시치(辨證施治)를 근간(根幹)으로 하여 건비익기(健脾益氣)를 위주(爲主)로한 부정거사법(扶正祛邪法)과 부정배본법(扶正培本法)이 많이 활용(活用)되고 있으며 부정법(扶正法)으로는 익기건비(益氣健脾), 자음보혈(滋陰補血), 온보비신(溫補裨腎) 등이, 거사법(祛邪法)으로는 활혈거어법(活血祛瘀法), 청열해독법(淸熱解毒法), 연견화담법(軟堅化痰法) 등이 활용(活用)되고 있는데, 이를 근거(根據)로 하여 한약(韓藥)의 복방(複方).단미(單味).단미추출물(單味抽出物) 등의 투여(投與)와 침(鍼) 구(灸) 수침(水鍼) 전침(電鍼) laser침(鍼)등의 치료방법(治療方法)을 수술(手術) 후(後) 혹(或)은 화학요법(化學療法)이나 방사선요법(放射線療法)와 병행(幷行)하여 치료효과(治療效果)가 향상(向上)되었다고 보고(報告)하고 있다. 항암제(抗癌劑)의 항암효과(抗癌效果) 정도(程度)를 검사(檢査)하는 방법(方法)은 크게 5가지로 분류(分類)되는데, 하나는 세포(細胞)를 약제(藥劑)에 노출(露出)시킨 후 현미경(顯微鏡)을 통하여 나타난 형태학적(形態學的) 변화(變化)를 가지고 약제(藥劑)의 효과정도(效果程度)를 결정(決定)하는 방법(方法)이고, 둘째는 Dye exclusion assay방법(方法)으로 살아있는 세포(細胞)가 trypan blue, eosin, nigrosin과 같은 염색액(染色液)에 염색(染色)되지 않는 점을 이용(利用)한 것이며, 세번째는 항암제(抗癌劑)의 항암효과(抗癌效果)를 알아보는 지표(指標)로 사용(使用)되는 Crrelease assay가 있으나, 세가지 방법(方法) 모두 현재(現在) 사용(使用)되고 있지 않다. 넷째로는 세포(細胞) 대사(代謝)의 방해정도(妨害程度)를 측정(測定)하거나 세포내(細胞內) 방사성(放射性) 동위원소(同位元素)의 유입방해(流入妨害) 정도(程度)를 측정(測定)하는 방법(方法)이 있고, 다섯째로는 본(本) 실험(實驗)에서 사용(使用)한 방법(方法)으로 stem cell assay라고도 하는 clonogenetic assay가 있는데, 이는 세포(細胞)를 약제(藥劑)에 노출(露出) 시킨 후 soft agar에 single cell suspension으로 배양(培養)하여 그 세포(細胞)의 분열(分裂).증식능력(增殖能力)을 측정(測定)하는 방법(方法)이다. 이 방법(方法)은 특히 성장(成長) 특성(特性)이 다른 종양세포(腫瘍細胞)의 경우 개개(個個) 세포(細胞)에 대한 약제효과(藥劑效果)를 반영(反映)할 수 있어서 종양세포(腫瘍細胞)의 이질성(異質性)에 따른 차이점(差異點)을 보정(補整)할 수 있는 방법(方法)이며, 1971년(年) Park 등이 마우스 골수종(骨髓腫) 세포(細胞)에 대한 stem cell assay를 시행(施行)해 본 결과(結果) in vivo에서의 결과(結果)와 잘 일치(一致)하여 그 이후로는 종양세포(腫瘍細胞)에 대한 항암제(抗癌劑)의 약제(藥劑) 감수성검사(感受性檢査)에 많이 사용(使用)되고 있다. 진령탕가감방은 담습응결(痰濕凝結)을 치료(治療)하는 효능(效能)을 가진 처방(處方)으로 거담작용(祛痰作用)을 가진 반하(半夏), 패모(貝母), 거습작용(祛濕作用)을 가진 의이인(薏苡仁), 백복령, 이기(理氣) 하기작용(下氣作用)을 가진 진피(陳皮), 대자석, 정향(丁香), 비파엽(枇杷葉), 항암작용(抗癌作用)을 가진 용규(龍葵), 반지련(半枝蓮), 모려(牡蠣), 하고초(夏枯草), 저령 등(等)의 약물(藥物)로 구성되어 있다. 근래(近來) 단일약물(單一藥物)의 항암효과(抗癌效果)에 대한 실험적(實驗的) 연구(硏究)로는 금(金) 등에 의한 인삼(人蔘), 녹용(鹿茸)의 항체생산(抗體生産) 억제(抑制) 완화효과(緩和效果) 및 임(任)에 의한 어성초(魚腥草), 녹혈(鹿血), 저령, 천산갑(穿山甲) 등이 정상(正常) 면역세포(免役細胞)에는 거의 독작용(毒作用)을 일으키지 않으면서 강력(强力)한 항암효과(抗癌效果)가 있다는 보고(報告), 금(金) 등에 의한 자완, 동풍채(東風菜), 영지(靈芝), 선학초(仙鶴草), 파두(巴豆) 등이 항암작용(抗癌作用) 및 면역반응(免疫反應)에 효과(效果)를 미친다는 보고(報告) 등이 있고, 복합제제(複合製劑) 약물(藥物)의 항암효과(抗癌效果)에 대한 연구(硏究)로는 강(姜) 등에 의한 식분환(息賁丸), 비기환(肥氣丸) 및 비기환이 백혈병(白血病)과 임파종환자(淋巴腫患者)에서 추출(抽出)한 암세포(癌細胞)에 항암효과(抗癌效果)가 있다는 보고(報告) 및 금(金) 등에 의한 복량환(伏梁丸), 비기환 및 소적정원산(消積正元散)이 각종(各種) 암세포주(癌細胞柱)이 성장저애(成長沮碍) 효과(效果), 윤(尹) 등에 의한 육군자탕(六君子湯), 소시호탕(小柴胡湯), 사묘탕(四妙湯), 대시호탕(大柴胡湯), 방독탕(防毒湯), 반하백출천마탕(半夏白朮天麻湯), 파두(巴豆)를 가미(加味)한 사군자탕(四君子湯) 및 사물탕(四物湯) 등이 항암작용(抗癌作用) 및 면역반응(免疫反應)에 효과(效果)를 보인다는 보고(報告) 등이 있었으나, 아직까지 진령탕가감방의 항암효과(抗癌效果)에 대한 실험연구(實驗硏究)는 없었다. 이에 저자(著者)는 항암효과(抗癌效果)가 있을 것으로 추정(推定)되는 진령탕가감방의 항종양효과(抗種瘍效果)를 알아보기 위하여, 수용성(水溶性) 추출액(抽出液)을 얻은 후 현대(現代) 병리학적(病理學的)으로 다용(多用)하는 colony형성억제실험(形成抑制實驗), SRB assay에 의한 항종양효과(抗種瘍效果), 생명연장율(生命延長率), 화학적(化學的)인 방법(方法)과 암종세포(癌腫細胞) 이식(移植)에 의한 종양(腫瘍) 유발(誘發)을 통하여 암(癌) 발생(發生) 및 그 경과(經過)에 미치는 영향(影響) 및 NK세포활성(細胞活性)에 미치는 영향(影響) 등을 관찰(觀察)하였다. 본(本) 실험(實驗)에서는 진령탕가감방의 종양세포(腫瘍細胞)에 대한 증식억제작용(增殖抑制作用)을 관찰(觀察)하고자 in vitro test인 colony형성억제실험(形成抑制實驗)과 SRB assay를 이용(利用)하였는데, 진령탕가감방의 추출액(抽出液)이 종양세포(腫瘍細胞)의 성장(成長)을 억제(抑制)하는 효과(效果)가 농도의존적(濃度依存的)으로 증가(增加)하는 결과(結果)를 보여 항종양(抗腫瘍)의 효과(效果)가 있음을 나타냈고(Table 3, 4), in vivo assay로서 sarcoma 180 복수암세포를 이식(移植)한 마우스의 평균생존일수(平均生存日數)를 관찰(觀察)하여 NCI protocol에 의하여 검정(檢定)한 결과(結果), 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 투여(投與)한 마우스의 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)이 뚜렷하게 증가(增加)되었다(Table 5). 또한 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 마우스에 투여(投與)하면 MCA로 유도(誘導)한 종양(腫瘍) 및 3LL 세포(細胞) 이식(移植)에 의한 종양(腫瘍)의 발생율(發生率) 및 발생(發生)된 종양(腫瘍)의 크기가 현저히 감소(減少)되었다(Table 6, 7). 이러한 효과(效果)는 진령탕가감방이 감수성(感受性) 암종세포(癌腫細胞)에 직접적으로 영향(影響)을 미쳐 그 증식(增殖)이 억제(抑制)되었을 가능성(可能性)을 생각할 수 있다. 그렇지만 본(本) 연구(硏究)에서는 암종특이성(癌腫特異性)에 관한 결론(結論)을 내릴 수는 없으므로 암종특이성(癌腫特異性)에 관한 연구(硏究)는 진행(進行)해야 할 것으로 생각된다. 또 다른 가능(可能)한 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양(抗腫瘍) 작용기전(作用機轉)은 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 NK세포(細胞)의 활성(活性)을 항진(亢進)시킨 실험결과(實驗結果)로 유추(類推)하여, 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 종양(腫瘍)마우스에 비특이적(非特異的)인 면역활성(免疫活性)을 촉진(促進)시킴으로써 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양작용(抗腫瘍作用)이 발현될 가능성(可能性)도 생각할 수 있다. 따라서 앞으로 여러 암종세포(癌腫細胞)에 대한 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양작용(抗腫瘍作用)과 종양동물(腫瘍動物)에서의 진령탕가감방 추출액(抽出液) 투여(投與)에 의한 생체생리현상(生體生理現象)의 변화(變化), 생리활성물질(生理活性物質)의 본능(本能) 등을 밝히기 위한 보다 구체적(具體的)이고 광범위(廣範圍)한 연구(硏究)가 수행(隨行)되어져야 되리라고 사료(思料)된다. 세포성(細胞性) 면역반응중(免疫反應中) 중요(重要)한 역할(役割)을 하는 작동세포중 NK세포(細胞)는 여러 종양(腫瘍)에 대해 자연살해능(自然殺害能)을 보여 소위 T비의존성(非依存性) 면역감시기전(免疫監視機轉)에 관하여는 바이러스 및 세균(細菌)에 감염(感染)된 세포(細胞)를 파괴(破壞)하는 활성(活性)을 가지며, IL-2 및 Interferon 등에 의하여 활성(活性)이 증가(增加)된다. NK세포(細胞)가 표적세포를 파괴(破壞)하는 기전(機轉)에 관해서는 아직 확실히 알려져 있지 않으나, 첫째로 표적세포를 인식(認識)하는 시기(時期), 둘째로 융해기전(融解機轉)을 활성화(活性化)시키는 시기(時期), 셋째로 NK lymphotoxin이 유리(遊離)되는 시기(時期), 넷째로 표적세포의 사멸기(死滅期)로 나눌 수 있다. 본(本) 실험(實驗)에서 진령탕가감방 추출액(抽出液)으로 전처리(前處理)시 NK세포(細胞)의 표적세포와의 결합능(結合能)은 물론 결합(結合)된 표적세포의 융해능(融解能)이 촉진(促進)된 결과(結果)를 보이는데(Table 8), 이와 같은 결과(結果)는 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 NK세포(細胞)의 표적세포 파괴 4단계 전체를 항진(亢進)시킨 결과(結果)로 인정(認定)된다. 이상에서 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 폐암세포주인 A549와 간암세포주인 hep3B 및 신장암 유래의 종양세포주인 Caki-1 cell에 투여(投與)한 결과, in vitro test인 colony형성억제실험(形成抑制實驗)과 SRB assay에서 모두 농도의존적(濃度依存的)으로 암세포주 성장(成長)을 억제(抑制)하였다. 2. Strcoma 180세포(細胞)를 마우스에 이식(移植)하여 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)을 측정(測定)하는 in vivo test에서는 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 마우스의 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)을 증가(增加)시키는 결과(結果)를 보였다. 3. 진령탕가감방 추출액(抽出液)은 MCA로 유도(誘導)한 종양(腫瘍)의 발생율(發生率) 및 발생종양(發生腫瘍)의 크기를 현저히 감소(減少)시켰으며, 3LL세포(細胞) 이식(移植)에 의한 종양발생(腫瘍發生) 또한 현저히 감소(減少)시켰다. 4. 진령탕가감방 추출액(抽出液)은 NK세포(細胞)의 활성도(活性度)를 증가(增加)시켰다. 특히 $10{\mu}g/ml$ 농도 에서 NK세포(細胞) 활성도(活性度)가 가장 현저히 증가(增加)되었다. 이상(以上)의 결과(結果)로 보아 진령탕가감방은 암종세포(癌腫細胞)에 대한 직접적(直接的)인 성장억제(成長抑制) 및 세포(細胞)의 활성(活性)을 통한 면역증진(免疫增進)에 의해 다양(多樣)한 항종양효과(抗腫瘍效果)를 보인 것으로 사료(思料)된다.