• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제7권4호
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• pp.229-236
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• 1997

A gene, $phbC_{2.4.1}$ encoding poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) synthase of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was cloned by employing heterologous expression in Escherichia coli. R. sphaeroides chromosomal DNA partially digested with MboI was cloned in pUC19 followed by mobilization into E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$ in pRK415, which code for ${\beta}$-ketothiolase and acetoacetyl CoA reductase of Alcaligenes eutrophus, respectively. Two E. coli clones carrying R. sphaeroides chromosomal fragment of $phbC_{2.4.1}$ in pUC19 were selected from ca. 10,000 colonies. The PHB-producing colonies had an opaque white appearance due to the intracellular accumulation of PHB. The structure of PHB produced by the recombinant E. coli as well as from R. sphaeroides 2.4.1 was confirmed by [$H^{+}$]-nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Restriction analysis of the two pUC19 clones revealed that one insert DNA fragment is contained as a part of the other cloned fragment. An open reading frame of 601 amino acids of $phbC_{2.4.1}$ with approximate M.W. of 66 kDa was found from nucleotide sequence determination of the 2.8-kb SaiI-PstI restriction endonuclease fragment which had been narrowed down to support PHB synthesis through heterologous expression in the E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$. The promoter (s) of the $phbC_{2.4.1}$ were localized within a 340-bp DNA region upstream of the $phbC_{2.4.1}$ start codon according to heterologous expression analysis.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권4호
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• pp.363-370
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• 1992

토양으로부터 PHB 생산능이 우수한 균주 FL-027을 분리하여 분류학적 제 특성을 검토한 결과 Alcaligenes속으로 동정되었다. Alcaligenes sp.의 최적 생육 조건은 과당 8.0$g/\ell$, $(NH_4)_2S0_4$ 3.0$g/\ell$ (즉 C/N molar ratio가 5.04) 및 pH7.0과 $30^{\circ}C$였으며, PHB 축적은 과당 8.0$g/\ell$, (NH4)2SO4 0.25g/l(즉 C/N molar ratio가 60) 및 pH6.5와 30'C에서 가장 양호하였다. $NH_4^+$, $Ca^{2+}$, $SO_4^{2+}$의 결핍이 PHB축적을 촉진하였으나 이들 중 $NH_4^+$가 가장 효과적으로 PHB축적을 유도하였다. 고농도배양을 위해 과당을 간헐적으로 첨가하여 최적농도를 유지하면서 유가배양을 실시한 결과 균체량은 25.1$g/\ell$, PHB 축적량은 10.84$g/\ell$로 건조균체량의 43까지 축적되었다. 분리정제된 PHB를 IR 및 $^1H-NMR$로 분석한결과 3-hydroxybutyric acid의 homopolymer임을 알 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제18권3호
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• pp.273-279
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• 1990

PHB 생산을 위하여 메탄올을 기질로 한 선별배지에서 토양, 하천수, 퇴비 등으로부터 분홍색 색소를 가지는 PHB 축적 facultative methylotroph를 분리하여, 균주의 특성을 검토하였다. 분리균주의 최적 생육조건과 PHB 축적을 위한 배양조건을 조사한 결과 균체의 생육은 메탄올 농도 1.0(v/v), 질소원인$ NH_4C$ 농도 1.0g/l, 즉 C/N ratio 13.2 일때 그리고 pH 7.0과'$30^{\circ}C$에서 가장 좋았으며, PHB는 C/N ratio가 50.8, 즉 메탄올 농도 1.0(v/v )$NH_4CL$ 0.26g/l 일때, 그리고 pH 6.0일 때 건조중량의 약 40까지 축적되었다. 고농도 메탄올에 의한 생육저해를 극복하기 위하여 기질을 간헐적으로 계속 공급해주는 fed-batch 배양을 시도한 결과 균체량은 14g/l, PHB 축척량은 5.5g/l까지 증가시킬 수 있었다. 생산된 PHB를 분리.정제하여 IR과 $^I H-NMR$로 구조를 분석한 결과 3-hydroxybutyric acid 의 homopolymer임이 확인되었다. 또한 균주의 pink-pigment를 추출하여 absorption spectrum를 조사하여 그 특성을 규명하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제34권3호
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• pp.273-278
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• 1991

Methanol 자화성 세균 Pseudomonas sp. ILS-003 균주를 이용하여 methanol로부터 PHB생산의 최적조건을 검토하였다. PHB 생산에 있어서 초기 pH 6.4, 온도 $30^{\circ}C$ 및 methanol 농도가 1.0(v/v)일 때 최적이었으며, 질소원으로는 $(NH_4)_2SO_4$가 최적이었으며 농도는 0.8g/l로서 C/N비가 17.4이었다. 또한 2가 금속이온의 결핍은 PHB축적효과를 나타내었다. Fed-batch culture에서 methanol 첨가의 효과는 0.25%(v/v)씩 첨가했을 때 가장 좋았다. 상기의 최적조건하에서 96시간 배양시 균체량은 2.78g/l였고 PHB의 양은 1.94g/l로서 건조균체량의 69.8%이었다.

• KSBB Journal
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• 제9권4호
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• pp.365-371
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• 1994

포도당의 초기농도 10, 20, 25, 30, 40, $50g/\ell$와 $NH_4Cl$의 초기농도 0.33, 0.4, 0.5, 1.5, 3, $50g/\ell$ 의 조 합으로 형성된 발효배지를 사용하여 탄소원과 질소 원의 초기 조성비 C/N이 각종 발효 변수의 수율 및 PHB 축적량에 마치는 영향을 규명하여 보았다. 탄소원의 소비량에 대한 균체 수율 $Y_{X/X}$는 C/N비가 증가함에 따라 대단히 완만하게 감소하였으며 C/N비 70 이상에서는 일정한 값 0.35( g cell biomassl g glucose)를 나타내였다. 잔여균체 수율 $Y_{RX/S}$C/N비가 증가하면 감소하며 C/N비 65 이상에서는 일정한 값 0.065( g residual biomassl g glucose)를 나타내였다. 그러나 PHB의 수율 $Y_{PHB/S}$는 C/N비의 증가에 따라 상승하여 C/N비 40 내지 60 사이에서 최대수율 0.35( g PHB/g glucose)를 나타내었다. 균체증가량에 대한 PHB의 생성수율 $Y_{PHB/S}$는 C/N비의 증가에 따라 증가하나 C/N비 70 이상에셔는 일정한 값 0.83( g PHB/g cell mass)을 유지하였다. 또한 잔여균체량에 대한 PHB의 생성수율도 C/N비 의 증가에 따라 증가하였으며 탄소원이 더이상 소모 되지 않는 상태에셔의 건조균체량에 대한 PHB 축 적률은 C/N비에 따라 상승하여 최대값 81%에 도 달하였다. 이 경우에 대한 C/N값은 67 근방이었으 며 이 이상의 C/N비에 대한 PHB의 축적률은 81% 로 일정하였다.

• KSBB Journal
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• 제6권1호
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• pp.35-43
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• 1991

The production of poly-$\beta$-hydroxybutyrate(PHB) from methanol by batch and fed-batch cultivations of Methylobacterium sp. GL-10 was studied. PHB accumulation was stimulated by the nutrients deficiency including, NH4+, SO42-, and K+. The nitrogen deficiency was the most critical factor for PHB accumulation. In batch cultivation, the maximum cell concentration and PHB content were 1.86g/l and 0.62g/l, respectively, with 1.0%(v/v) of methanol and 0.5g/1 of ammonium sulfate. The mass doubling time of Methylobacterum sp. GL-10 was in the range of 4-5 hrs. The cell growth and PHB accumulation were severely inhibited at the methanol concentration over than 2% (v/v). To overcome methanol Inhibition, constant feeding and intermittent feedillg fed-batch cultivations were adopted, using C/N molar ratio as a control factor. In constant feeding fed-batch process, cell concentration was increased up to 2.67g/1, and PHB yield was enhanced from 0.33 of batch culture to 0.53. The relatively low cell concentration was caused by methanol accumulated in culture broth at late growth phase. To prevent methanol accumulation and to maximize PHB production, DO-state intermittent fed-batch cultivation was attempted. The cell and PHB concentration was reached up to 4.55g/1 and 1.80g/1, respectively. It was possible to maintain methanol concentration low and also to feed nutrient of desired C/N molar ratio.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제11권2호
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• pp.333-336
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• 2001

An isolated phbC gene from Alcaligenes latus was reintroduced into the parent A. latus through the transformation process, and the effect of the amplified phbC gene on the biosynthesis of P(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-3HV)] and P(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate) [P(3HB-4HB)] in the transformant A. latus was investigated. The biosynthesis rate and content of the above copolymers increased up to 1.3-fold after enforcing its own phbC gene, and the molar fractions of 3HV and 4HB in P(3HB-3HV) and P(3HB-4HB) also changed remarkably from 35.0 to 48.0% and from 34.0 to 56.0%, respectively, showing a critical role of PHB synthase which catalyzes the polymerizing reactions between eiher 3HV or 4HB from precursor compounds and 3HB.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권1호
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• pp.71-77
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• 2010

The time, yield, and related genes expression of PHB accumulation of Acidiphilium cryptum DX1-1 were investigated under four different initial C/N ratios, 1.2, 2.4, 7.5, and 24. The results of time and yield of poly-$\beta$-hydroxybutyrate (PHB) accumulation show that the initial C/N ratio of 2.4 was optimum for strain DX1-1 to accumulate PHB, but both higher and lower initial C/N ratios did not favor that process. Based on the genome of Acidiphilium cryptum JF-5, 13 PHB accumulation related genes in strain JF-5 were chosen and successfully cloned from strain DX1-1. The differential expressions of the 13 functional genes, in different C/N ratios as cited above, were then studied by real-time PCR. The results show that all the 13 genes were most upregulated when the initial C/N ratio was 2.4, and among which the gene Acry_3030 encoding poly-$\beta$-hydroxybutyrate polymerase and Aery_0626 encoding acetyl-CoA synthetase were much more upregulated than the other genes, which proved that they play the most important role for PHB accumulation, and acetate is the main initial substance for PHB accumulation for strain DX1-1. Potential regulatory motifs analysis showed that the genes related to PHB accumulation are regulated by different promoters and that the motif had weak similarity to the model promoters, suggesting that PHB metabolism in Acidiphilium cryptum may be mediated by a different mechanism.

• 생명과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1625-1630
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• 2008

본 연구는 생분해성 플라스틱인 poly-${\beta}$-hydroxybutyrate (PHB)의 생산단가를 낮추기 위한 노력으로 저가의 기질로부터 PHB 대량생산을 위한 기초자료를 얻는데 그 목적을 두었다. Hemicellulose hydrolysate는 지구상에 풍부하게 존재하는 저가의 waste by-product로서 xylose가 많이 포함되어 있다. 본 연구에서는 xylose로부터 PHB를 생산할 수 있는 균주를 토양에서 분리하여, 분류학적 위치를 밝히고, 균체 생육 최적 조건, PHB 생산을 위한 최적 발효 배양 조건, PHB의 구조 확인 등을 검토 하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 토양으로부터 분리한 균주 J-65는 형태학적, 배양적, 생화학적 및 partial 16S rRNA sequence에 근거하여 Bacillus megaterium로 동정하였다. B. megaterium J-65의 균체 생육 최적 조건은 온도 $37^{\circ}C$, 초발 pH 8.0이었으며 2% xylose, 0.25% $(NH_4)_2SO_4$, 0.3% $Na_2HPO_4{\cdot}12H_2O$, 0.1% $KH_2PO_4$였다. PHB 축적에 영향을 미치는 요인을 검토하기 위해 균체생육 최적배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간 1차 배양한 후, 균체를 회수하여 각종 영양분이 결핍된 배지에 2차 배양을 실시한 결과 B. megaterium J-65는 균형생육조건(balanced-growth condition)에서 PHB를 합성하는 균주로 나타났다. PHB보다 물성이 향상된 PHB/HV 공중 합체를 생산하기 위하여 보조기질로 propionic acid를 첨가하였을 때, 0.1% propionic acid 농도에서 HV mol%가 14%인 PHB/HV 공중합체가 합성되었다. 5 l 용량의 발효조에 B. megaterium J-65를 회분배양하였을 때 배양 21시간에 건조균체량 10 g/l, PHB 3.5 g/l를 얻을 수 있었고, 유가배양을 실시한 결과 배양 48시간에 건조균체량 26.52g/l, PHB 9.28 g/l를 얻을 수 있었다. 생산된 PHB를 alkaline solution 처리와 chloroform을 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출.정제한 후 Gas Chromatography로 정제를 확인하고 300MHz 1H-NMR을 실시한 결과 3-hydroxybutyrate의 homopolymer임을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제23권2호
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• pp.220-228
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• 1995

For polyhydroxyalkanoic acid (PHA) production, several microorganisms were isolated from sewage sludge. One of them, GB-77 strain, was chosen from its PHB/HV copolymer production on only fructose without cosubstrate. The isolated strain GB-77 was identified as the genus Alcaligenes. Optimal temperature and pH for cell growth were 36C and 6.8. Optimal medium composition was 10 g/l of fructose and 5 g/l of polypeptone, 1 $\times$ 10$^{-2}$M Na$^{2}$HP0$^{4}$, 1.3 $\times$ 10$^{-2}$M KH$^{2}$PO$^{4}$. To investigate the optimal condition for polyhydroxyalkanoic acid production two-stage culture technique was used; first stage for cell growth and second stage for PHA production on unbalanced growth conditions. Optimal conditions for high PHA production were C/N ratio 50, temperature 36$\circ$C and pH 6.8. To overcome fructose inhibition on cell growth, intermittent feeding fed-batch culture technique was used. Total cell concentration was 17.4 g/l with 9.1 g/l of PHA. The purified PHA was identified PHB/HV copolymer by NMR analysis.