Development of multiplex PCR-based detection method for five approved LM canola events in Korea

Canola is a crop globally used for production of oil and biofuel. Cultivation area and import volume of living modified (LM) canola have been increasing every year. As canola import dependence has reached 100% in Korea, efforts have been made for safety management of LM canola and ecological risk assessment. We developed a set of multiplex PCR method for simultaneous detection of 5 LM canola events (Topas 19/2, Rf3, Ms8, RT73 and T45) approved in Korea. The multiplex PCR assay developed allows amplification of estimated products of 5 LM canolas from event specific primer sets. Primer extension time was skipped for a time-consuming process and two annealing steps (20 cycles at $55^{\circ}C$ and 20 cycles at $60^{\circ}C$) were performed for yielding the best result which was sufficient to distinguish five LM canolas. Our results suggest that multiplex PCR method provides a cost and time-effective approach for LM canola detection.

Multiplex PCR 방법을 이용한 국내 승인 5개 LM 유채의 검출법 개발

캐놀라(canola)는 식용유 및 바이오 에너지 생산을 위해 전 세계적으로 널리 재배되는 작물이다. 캐놀라의 수요가 증가하면서 유전자변형 캐놀라에 대한 중요성이 높아짐에 따라 LM 캐놀라 재배면적이 해마다 증가하고 있다. 국내에서는 상업적으로 활용되는 캐놀라를 100% 전량 수입에 의존하고 있으며, 이에 따라 비의도적으로 유출 가능성이 있는 수입 LM 캐놀라의 안전관리 및 생태계 위해성 평가가 요구된다. 본 연구에서는 국내 수입 승인 유통 LM 캐놀라 5개 이벤트(Topas 19/2, Rf3, Ms8, RT73, T45)의 명확한 검출을 위한 동시증폭 검출법(multiplex PCR)을 확립하고자 하였다. PCR 반응 조건은 5개 LM 이벤트가 동시에 명확히 검출되는 최적 primer 농도 및 반응 조건을 통해 Topas 19/2 (95 bp), Rf3 (139 bp), Ms8 (250 bp), RT73 (317 bp), T45 (378 bp)의 서로 다른 생성물 크기로 명확히 구분되도록 하였다. 최적 primer 농도는 반응액 최종농도 0.3~1.0 pmol로 primer 쌍 마다 각각 다른 cocktail을 만들었고, PCR 반응 조건은 $95^{\circ}C$ 5분 반응 후, $95^{\circ}C$ 15초, $55^{\circ}C$ 20초 20회 반응하고, 다시 $95^{\circ}C$ 15초, $60^{\circ}C$ 20초 20 회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌다. 본 연구의 결과로 제시된 multiplex PCR 검출 조건은 국내 수입 유통 LM 캐놀라의 자연환경 모니터링을 위한 검출에 있어 소요되는 연구인력, 비용 및 시간을 보다 효율적으로 개선할 수 있을 것으로 사료된다.