An Improved Method to Determine Corn (Zea mays L.) Plant Response to Glyphosate

Several methods for determining the response of corn to glyphosate were investigated to provide a fast and reliable method for identifying glyphosate-resistant corn in vivo. Two bioassays were developed. One assay is named 'whole plant / leaf growth assay', in which the herbicide glyphosate is applied on the upper part of 3rd leaf and the growth of herbicide-untreated 4th leaf is measured at 3 day after treatment. in this assay, the leaf growth of conventional corn was inhibited in a dose dependent from 50 to $1600{\mu}g/mL$ of glyphosate and growth inhibition at $1600{\mu}g/mL$ was 55% of untreated control. The assay has the potential to be used especially in the case that the primary cause of glyphosate resistance is related with a reduction of the herbicide translocation. Another assay is named 'leaf segment / shikimate accumulation assay', in which the four excised leaf segments ($4{\times}4mm$) are placed in each well of a 48-well microtiter plate containing $200{\mu}L$ test solution and the amount of shikimate is determined after incubation for 24 h in continuous light at $25^{\circ}C$. In this assay, 0.33% sucrose added to basic test solution enhanced a shikimate accumulation by 3 to 4 times and the shikimate accumulation was linearly occurred from 2 to $8{\mu}g/mL$ of glyphosate, showing an improved response to the method described by Shaner et al. (2005). The leaf segment / shikimate accumulation assay is simple and robust and has the potential to be used as a high throughput assay in the case that the primary cause of glyphosate resistance is related with EPSPS, target site of the herbicide. Taken together, these two assays would be highly useful to initially select the lines obtained after transformation, to investigate the migration of glyphosate-resistant gene into other weeds and to detect a weedy glyphosate-resistant corn in field.

Glyphosate에 대한 옥수수 반응의 개선된 검정방법

본 연구에서는 옥수수를 대상으로 glyphosate에 대한 여러 가지 생리적 반응을 검토한 후, glyphosate 저항성 평가에 활용될 수 있는 보다 개선된 방법 두 가지를 확립하였다. 한 가지 방법은 옥수수 제3엽 상단에 약제를 국소 처리한 다음, 처리 후 3일째에 약제처리 되지 않았던 제4엽의 신장 정도를 조사하는 것이다 (전식물체-엽생장 검정). 이 경우 glyphosate $50-1,600{\mu}g/mL$ 범위에서 농도가 증가됨에 따라 엽 생장이 억제되었으며, $1,600{\mu}g/mL$ 농도에서의 생장 억제율은 무처리 대비 55.5%였다. 다른 한 가지 방법은 옥수수 제3본엽의 엽절편 ($4{\times}4mm$) 4개씩을 $200{\mu}L$의 시험용액이 담긴 48 well plate에 치상한 후 $25^{\circ}C$ 연속 명조건에 24시간동안 배양하여 shikimate 축적량을 조사하는 것이다 (엽절편-shikimate 축적 검정). 이 경우 시험용액에 0.33% sucrose를 가하면 무첨가에 비해 약3-4배 정도의 shikimate 축적 증가가 관찰되었고 glyphosate $2-8{\mu}g/mL$ 농도범위에서 직선적 증가반응을 나타내어 기존방법 (Shaner et al. 2005)보다 개선된 특징을 보였다. 본 방법들은 glyphosate 저항성 옥수수를 창출할 때 또는 저항성 유전자의 타 식물로의 이동여부와 잡초화된 저항성 옥수수 존재여부를 감별하는데 활용될 수 있을 것이다. 이 때 glyphosate에 대한 저항성 원인이 작용점 EPSPS와 관련이 있는 경우에는 "엽절편-shikimate 축적 검정"이 가장 바람직하고, 저항성 원인이 체내이행 감소 때문일 경우에는 "전식물체-엽생장 검정" 수행이 필요하다.