A Potent Tissue Destructive Activity of Secreted Proteins of Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila is the most common water fish pathogen and cause diseases such as hemorrhagic septicemia, dropsy, ulceration and asymptomatic septicemia. A. hydrophila secretes many extracellular products (ECPs) which contribute to effective infection, wide distribution and great adaptability to environmental changes. Crude ECPs of A. hydrophila CK257, a strain used in this study, exhibits a toxic activity to the animals including mouse, rabbit and fish. Toxic symptoms were indicated by tissue damage and skin injuries in animal. When ECPs were subcutaneously injected to animals, skin damages were observed, appearing like necrosis. Preliminary research demonstrated that the active factors are protein component. The crude ECPs were collected after ammonium sulfate precipitation of cell-free culture supernatant. ECPs were fractionated with the use gel filtration chromatography. Five ECP fractions were obtained, of which one fraction was found to be toxic to goldfish. MALDI-TOF analyses provided two interesting proteases called M35 and M28. Both M35 and M28 are known as metalloprotease. Accordingly, proteins in an active fraction exhibited caseinolytic activity. These proteins were difference of caseinolytic activity under different metallic ions. Also active fraction has elastolytic activity. These results suggested that peptidase M28 and M35 may be a candidate factor for tissue necrosis activity about infection with A. hydrophila.

조직 괴사 활성을 지닌 Aeromonas hydrophila 의 분비 단백질에 관한 연구

Aeromonas hydrophila는 수생계에 흔히 존재하는 병원체로서 출혈성 패혈증, 수종, 궤양 등의 질병을 유발한다. A. hydrophila는 효과적인 감염과 다양한 환경에서 적응하기 위해 세포 외 물질(Extracellular products, ECPs)을 분비한다. 본 연구에서 사용한 A. hydrophila CK257은 매우 독성이 강한 균주로 균이 분비하는 ECP 역시 쥐, 토끼, 금붕어를 포함한 동물 모델에게 조직 손상을 일으키며 독성을 보였다. 이러한 괴사 반응을 일으키는 원인 요소를 찾기 위해 ECP의 특성을 분석하였고 그 결과, 원인 요소가 단백질이라는 것을 확인하여 이후 단백질 분리 및 정제에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다. 균체를 제거한 배양액 상의 분비 단백질을 얻기 위하여 ammonium sulfate 침전법을 사용하였고, 이후 겔 거르기 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)를 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제 후 단백질은 다섯 개의 분획으로 나뉘었고 이 중 한 개의 분획이 동물 모델에 괴사와 같은 피부 손상을 일으키는 것을 확인하였다. 괴사 활성을 가진 분획의 단백질 4개의 밴드를 MALDI-TOF 시스템을 통해 분석한 결과, Peptidase M35와 Peptidase M28로 밝혀졌으며 이들은 각각 금속촉매효소(metalloprotease)임을 확인할 수 있었다. Peptidase M35와 Peptidase M28의 단백질 분해 효소로써의 기능을 확인하기 위해 카제인 분해 활성을 확인하였고, 다양한 금속 이온을 처리함에 따라 그 활성이 달라지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 조직에 존재하는 단백질의 한 종류인 엘라스틴(elastin) 분해능 역시 확인해 보았다. 본 연구에서는 A. hydrophila가 분비하는 물질 가운데 조직 괴사 활성을 일으키는 것으로 추정되는 Peptidase M35와 Peptidase M28의 두 가지 인자를 확인하여 동정하였다. 이후 두 가지 인자를 결손 시킨 돌연변이주를 구축하여 조직 괴사에 이들이 직접적으로 작용하는지 확인 할 예정이다.