Induction and resuscitation of viable but nonculturable Edwardsiella tarda

Bacteria in the viable but nonculturable (VBNC) state fail to produce colonies on routine bacteriological media, but are still alive in the state of very low metabolic activity. The aim of the present study was to induce the VBNC state of the Edwardsiella tarda using sea water microcosm under starvation conditions at $10^{\circ}C$ and to investigate resuscitation of the VBNC cells in temperatures changed from 10 to $25^{\circ}C$, with and without additives. E. tarda entered into the VBNC state within about 42-84 days of incubation in the microcosm. Throughout this period, the total cell counts as determined using acridine orange direct counting remained near the original inoculum level of ${\sim}10^8cells/ml$. The live cell counts measured with direct viable counting, on the other hands, declined to ${\sim}10^4cells/ml$. When the VBNC cells were incubated with addition of yeast extract, fish muscle extract or serum at $25^{\circ}C$, the ratios of resuscitated samples were 37%, 23%, and 37%, respectively. The characteristics of resuscitated E. tarda were consistent with those of the original E. tarda. When the resuscitated E. tarda were intraperitoneally injected into olive flounders, all fishes died within 5 days, indicating that the VBNC E. tarda might retain its pathogenic potential. Therefore, E. tarda under starvation conditions in the winter enter into the VBNC state and the VBNC E. tarda cells resuscitated at summer and autumn seawater temperature are considered to be pathogen continuously to olive flounder on the southern coast of Korea.

Edwardsiella tarda의 비배양성 생존상태(VBNC) 유도 및 소생 특성

Viable but nonculturable (VBNC) 상태에 들어간 세균은 일반적인 증균 배지에서는 집락을 형성하지 않지만, 죽은 것이 아니라 낮은 대사활성상태로 유지되고 있다. 본 연구에서는 $10^{\circ}C$의 저온 빈영양 해수에서 Edwardsiella tarda를 VBNC 상태로 유도한 후, 해수 온도를 10에서 $25^{\circ}C$로 상승시킬 때 첨가된 유기물의 종류에 따라 VBNC 상태인 균의 소생 가능성을 알아보고자 하였다. E. tarda가 접종된 빈영양 해수 microcosm을 $10^{\circ}C$에 유지하였을 때 VBNC 유도 기간은 42-84일까지 다양하였다. 유도 기간 동안 acridine orange direct counting법으로 계수한 총 균수는 초기 접종 농도인 약 $10^8cells/ml$로 일정하였으며, direct viable counting법으로 계수한 생존 균수는 약 $10^4cells/ml$로 감소되었다. VBNC E. tarda에 효모추출물, 넙치근육추출물 그리고 혈청을 첨가하여 $25^{\circ}C$에서 소생을 유도한 결과 전체 시료 개수의 37%, 23%, 37%에서 각각 소생이 확인되었으며 소생된 E. tarda의 특성은 VBNC 유도 전 원래의 세균과 일치하였다. 소생된 E. tarda를 넙치(Paralichthys olivaceus)에 복강 주사 하였을 때 접종 후 5일 이내에 시험어가 모두 사망함으로써 VBNC 상태의 E. tarda가 독력을 유지하고 있었음을 시사하였다. 그러므로 E. tarda는 우리나라 남해 연안 겨울의 저온 빈영양 해수에서 VBNC 상태로 유도되었다가 여름과 가을 시기에 수온 상승과 더불어 소생되어 양식 넙치에 지속적인 발병 요인이 되고 있는 것으로 생각된다.