3-Dimensional Reconstruction of Parallel fiber-Purkinje Cell Synapses Using High-Voltage Electron Microscopy

Synapses are contact points where one neuron communicates with another. The morphological change of synapses under various physiological or pathological conditions has long been hypothesized to modify their functional properties. 3-dimensional (3-D) reconstruction of synapses with serial ultrathin sections has contributed to the understanding of ultrastructural dimensions and compositions of synapses. The 3-D reconstruction procedures, however, require a great amount of expertise as well as include prohibitively timeconsuming processes. Here, we introduce efficient 3-D reconstruction technique using high-voltage electron microscopy (HVEM). Primarily, we established an optimal section thickness and staining condition to observe synaptic structures in detail under HVEM. The result showed that synaptic profiles were preserved at the section thickness of 250 nm without the overlapping of synaptic ultrastructures. An increase in the reaction time of en bloc staining was most efficient to enhance contrast than the extension of postembedding staining or the addition of uranyl acetate during dehydration. Then, 3-D reconstruction of parallel fiber-Purkinje cell synapses in the rat cerebellum was carried out with serial HVEM images and reconstruction software. The images were aligned and the contours of synapses were outlined on each section. 3-D synapses were finally extracted from the section files by grouping all the synaptic contours. The reconstructed synapse model clearly demonstrated the configuration of pre and postsynaptic components. These results suggest that 3-D reconstruction of synapses using HVEM is much efficient and suitable for massive quantitative studies on synaptic connectivity than conventional TEM approach using numerous ultrathin sections.

고압전자현미경을 이용한 소뇌 평행섬유-조롱박세포간 신경연접의 3차원 재구성

신경연접은 신경세포 사이의 신호전달을 위해 형성되는 미세구조로 다양한 생리적, 병리적 상태에 반응하여 형태적, 기능적 변화를 보인다. 현재까지 투과전자현미경을 이용한 신경연접 미세구조의 2차원적 연구들이 많은 유용한 정보를 제공하여 왔으나 신경연접 구성요소들을 보다 정확하게 분석하고 전신경연접부위와 후신경연접부위의 정확한 연결관계를 이해하기 위해서는 신경연접의 3차원 재구성이 요구된다. 고압전자현미경은 고해상도와 시료투과력의 증가로 인해 두꺼운 절편의 관찰이 가능하며 이를 통해 미세구조의 3차원적 특성을 규명하는 것이 용이하므로, 신경연접의 3차원 재구성에 고압전자현미경을 응용하는 것은 많은 수의 연속절편 제작과 오랜 기간의 영상처리가 요구되는 기존의 재구성 방법의 난점들을 극복할 수 있을 것으로 생각된다. 이에 본 연구에서는 고압전자현미경을 이용하여 흰쥐 소뇌 평행섬유와 조롱박세포 간 신경연접의 3차원 재구성을 시도하였다. 3차원 재구성에 앞서 염색방법과 절편 두께의 조절을 통해 고압전자현미경 하에서 신경연접의 적절한 관찰조건을 확립하고자 하였다. 관찰 결과, 절편의 두께가 증가하면 신경연접의 막, 소포와 같은 미세구조들의 겹침 현상이 나타나기 때문에 용이한 3차원 재구성을 위해서는 250 nm 두께의 절편을 제작하는 것이 적합한 것으로 판단되었다. 또한 절편제작 이전의 en bloc 염색 반응시간을 증가시키는 것이 절편제작 후 염색시간을 조절하는 것에 비해 contrast 증가에 더 효과적이었다. 이상의 결과로부터, 고압전자현미경을 이용하여 일련의 두꺼운 연속 절편을 촬영하고 3차원 재구성 프로그램을 이용하여 이미지들을 정렬하였으며 각각의 이미지에서 신경연접 막의 윤곽선을 그린 후 모든 윤곽선을 쌓아 올려 최종적으로 3차원 신경연접을 재구성하였다. 본 연구를 통하여 신경연접의 3차원 재구성에 있어 고압전자현미경의 적용 가능성을 검증하였고 관찰 조건을 확립하였다. 또한 고압전자현미경을 이용한 신경연접의 재구성은 많은 수의 연속절편 제작이 요구되는 기존의 방법에 비해 효율적이며 신경연접 연결형태에 관한 대규모의 정량 분석에 유용할 것으로 생각된다. 본 연구가 향후 고압전자현미경을 이용한 신경연접의 가소성 연구에 유용한 방법적 정보를 제공하기를 기대한다.