The Effect of Modified Cryopreservation Method on Viability of Frozen-thawed Blastodermal Cells on the Korean Native Chicken(Ogolgye Breed)

For reconstituting genetic resource(Korean Native Chicken: KNC) with grem-line chimeric chicken made with cryopreserved biastdermal cells, the experiments were carried out to optimize cryopreservating conditions. Stage X biastdemal cells were collected from KNC embryos and dissociated. Cells were susupended in medium containing cyopretectant and fetal bovine serum(FBS), and distributed into plastic ampules. Cell susupensions were seeded to induce ice formation at $-7^{\circ}C$ to $-35^{\circ}C$ at in the experiments, the effect of modification of dissociation way, concentration of FBS and cell density on the vaibility of frezen-thawed cells were investigated by trypan blue exclusion. Then change the way of cell dissociation from pipetting to short time vortexing, viability of frozen-thawed cell tended to be increaced from 29 % to 52 %. Increase concentraition of FBS in frozen medium from 20 % to 80 % made viability of thawed cell from 28 % to 35 %. The viability of thawed cells were 33.9% frozen at 2 embryos/0.5 ml, and 43.6 % frozen at 20 embryos/0.5 ml. Furthermore, combination of three modifications make big improvement. The viability of frozen-thawed cell was 60 % for combinated method, and 41 % for general method. This result means the advance to practical cryoreservation of blastdermal cell of the KNC(Ogolgye breed).

한국재래닭(오골계)종 배반엽세포에 있어서 동결 방법의 개선이 융해 후 생존율에 미치는 영향

귀중한 한국재래닭의 배반엽세포를 냉동보존하고, 키메라 닭을 통한 재래종의 복원을 도모하는 방법을 실용화하기 위해서, 한국재래종의 배반엽세포에 있어 최적의 동결 방법에 대해 검토했다. 배반엽세포의 동결은 세포를 단리한 후, 항동해제와 소태아혈청(FBS)를 함유하고 있는 동결용액 중에 부유하고 수지성 동결용기 중에 넣고, $-7^{\circ}C$에서 동결시키고 나서 분당 $-1^{\circ}C$에서 $-35^{\circ}C$까지 냉각하고 액체질소 안에 침지시켜서 실험을 진행했다. 동결조작 중에서 (1) 동결 전의 세포의 단리 방법, (2) FBS 농도, (3)동결 시 세포밀도가 동결융해 후의 세포생존율에 미치는 영향을 조사했다. (1) 세포의 단리 방법을 피펫팅으로부터 시험관 믹서에 의한 단시간의 flushing으로 변경하면, 동결융해 후의 세포의 생존율이 29%부터 51%로 향상된다. (2) 동결용액 속 FBS 농도를 20%에서 80%로 증가시키면 동결융해 후의 생존율이 28%에서 35%로 증가한다. 또한, (3) 융해 후, 생존율은 (2개의 배자/0.5 ml) 처리군에서의 동결은 34%인 반면에, (20개의 배자/0.5 ml)에서는 44%였다. 더욱이, 이 세 가지 개선점을 조합함으로써 동결융해 후의 생존율은 60%로, 개선 전의 41%에 비하여 크게 개선이 될 수 있고, 한국재래종의 배반엽세포의 동결보존의 실용화가 보다 더 향상될 수 있는 방법이 될 수 있음을 시사한다.