Effects of puromycin aminonucleoside on the cytoskeletal changes of glomerular epithelial cells

Purpose : This study was designed to clarify the mechanism of proteinuria in nephrotic syndrome patients by using puromycin aminonucleoside (PAN) nephrosis model. Methods : Following administration of various concentrations of PAN and antioxidants we observed the changes of podocyte cytoskeletons in cultured rat glomerular epithelial cells (GEpC) by method of scanning electron microscope, reactive oxyten species (ROS) analysis, permeability assay, confocal microscope, and Western blot assay. Results : PAN not only induced the ultrastructural changes of GEpC, such as shortening and fusion of microvilli, but also separated the intercellular gaps and linear ZO-1. PAN induced oxidative stresses in time and dose dependent manners and increases of intercellular permeability in anti-oxidants inhibitable manners. High concentration of PAN induced not only actin polymerization and disorganization, but also the conglomerulation and internal dislocation of ${\alpha}-actinin$ protein. The intensities of fluorescences of ZO-1 protein were diminished and internalized by PAN in a dose-dependent manner, which were inhibited by anti anti-oxidants. Conclusion : PAN induced the changes of podocytes cytoskeleton and junctional barriers by way of increasing ROS in GEpC that resulted in increasing their permeability in a antioxidatn-inhibitable manner. Glomerular hyperpermeability induced by PAN mediateing through oxidative stresses is thought to take part in the mechanism of proteinuria in nephrotic syndrome.

Puromycin aminonucleoside의 사구체 상피세포에 대한 영향

목 적 : 특발성 신증후군의 연구를 위하여 병태생리 및 임상소견과 유사한 실험적 puromycin aminonucleoside(PAN) 신증을 이용하는데 본 연구는 배양한 사구체 상피세포에 대한 PAN의 영향을 통하여 신증후군의 주 원인 병태생리인 단백뇨의 기전을 밝히고자 하였다. 방 법 : 사구체 상피세포를 배양한 후 다양한 농도의 PAN과 항산화제를 투여하여 전자현미경관찰, 반응성 산소종 투과율 변화, confocal microscopy 등을 통하여 족세포성분의 변화를 관찰하였다. 결 과 : 사구체 상피세포의 초고배율소견에서 PAN에 의해 세포간극이 벌어지고 표면의 미세돌기가 단축되는 변화를 볼 수 있었다. 이러한 세포간극의 변화는 세포막부분의 ZO-1에 대한 면역형광검사에서도 확인할 수 있었다. DCF-DA로 측정한 반응성 산소종은 PAN에 의하여 농도에 따라 투여 2시간에 이미 유의한 증가를 보이나, 이러한 변화는 항산화제인 EGCG, probucol, vitamin C에 의해 감소하였다. 또한, 세포단층모델에서 투과율은 PAN에 의하여 농도에 따라 증가하나 항산화제에 의해 증가가 억제되었다. 세포골격구조인 ${\alpha}-actinin$은 사구체 상피세포의 세포질과 바깥 세포막부분으로 actin과 같이 분포하나 고농도의 PAN에 의해 세포질 바깥쪽의 일부분에 집중하는 형상으로 변하였다. 그러나 이러한 변화는 항산화제인 vitamin C의 처치에 의해 예방될 수 있었다. 세극막성분인 ZO-1는 고농도의 PAN에 의해 안쪽으로 이동하고 집중하는 형상으로 변하였으나, vitamin C의 처치에 의해 예방되었다. 이와 함께 ${\alpha}-actinin$과 ZO-1은 PAN에 의해 단백양이 감소하였으나 이는 항산화제에 의해 예방할 수 있었다. 결 론 : PAN은 사구체 상피세포의 반응성 산소종 생성을 증가시키고, 구조성분의 변화를 통하여 형태학적인 변화를 초래하며 이는 투과율의 증가로 나타났다. 이러한 변화들은 항산화제에 의해 어느 정도 억제할 수 있었음으로, PAN은 생체 외 사구체 상피세포에 산화스트레스기전을 통하여 구조적 변화와 이에 따른 단백뇨를 유발시키는 것으로 사료된다.