THE EFFICACY OF PROGRAMMED CRYO-PRESERVATION UNDER PRESSURE IN RAT PERIODONTAL LIGAMENT CELLS

The purpose of this study was to evaluate the viability of periodontal ligament cells in rat teeth using slow cryo-preservation method under pressure by means of MTT assay and WST-1 assay. Eighteen teeth of Sprague-Dawley white female rats of 4 week-old were used for each group. Both sides of the first and second maxillary molars were extracted as atraumatically as possible under Tiletamine anesthesia. The experimental groups were group 1 (Immediate control), group 2 (Cold preservation at $4^{\circ}C$for 1 week), group 3 (Slow freezing), group 4 (Slow freezing under pressure of 3 MPa). F-medium and 10% DMSO were used as preservation medium and cryo-protectant. For cryo-preservation groups, thawing was performed in $37^{\circ}C$water bath, then MTT assay and WST-1 assay were processed. One way ANOVA and Tukey method were performed at the 95% level of confidence. The values of optical density obtained by MTT assay and WST-1 were divided by the values of eosin staining for tissue volume standardization. In both MTT and WST-1 assay, group 4 showed significantly higher viability of periodontal ligament cells than group 2 and 3 (p < 0.05), but showed lower viability than immediate control group. By the results of this study, slow cryo-preservation method under pressure suggests the possibility for long term cryo-preservation of the teeth.

압력 저속 냉동 방법의 쥐 치아 치주인대세포 보존 효율 평가

본 연구의 목적은 흰 쥐의 상악 대구치를 발거한 후 치주인대세포를 압력을 이용한 저속 냉동 보관법으로 냉동 보관시 치주인대세포의 활성도를 저속 냉동법, 냉장 보관법과 비교하여 평가하고자 하였다. 생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐의 상악 좌우 제 1,2 대구치를 발거하여 각 군 당 18개의 쥐 치아를 MTT, WST-1 검색에 이용하였다. 실험군은 4개군으로 대조군은 즉시 발치군이며, $4^{\circ}C$냉장고에 일주일간 보관한 냉장군, 발치 후 동해방지제 처리과정을 거쳐 $4^{\circ}C$에서 $-35^{\circ}C$까지 $-0.5^{\circ}C$/min 속도로 서서히 냉동시킨 뒤 $-196^{\circ}C$에 냉동한 저속 냉동군, 3MPa의 압력을 가하고 $-0.5^{\circ}C$/min 속도로 $4^{\circ}C$에서 $-35^{\circ}C$까지 서서히 냉동시킨 뒤 $-196^{\circ}C$에 냉동한 압력 저속 냉동군으로 나누었다. 보존액은 F medium을 사용했으며 동해방지제로 10% dimethylsulfoxide(DMSO)를 사용하였다. 일주일 후 해동하여 MTT, WST-1검색을 시행한 뒤 치근면을 단위면적으로 표준화하기 위해 MTT, WST-1 측정값을 Eosin 염색 후 530nm에서 측정한 흡광도 값으로 나누었다. 통계 분석을 위해 one way ANOVA를 시행하였으며 사후 검정으로는 Tukey 방법을 사용하였고 결과는 다음과 같다. 1. MTT 검색에 의한 흡광도를 Eosin 염색 후 측정한 흡광도로 나눈 값에서는 압력 저속 냉동군은 즉시 발치군보다 유의성 있게 세포 활성도가 낮았으나(p<0.05), 저속 냉동군이나 냉장군과 비교할 때는 높은 세포 활성도를 보이며 통계적 유의성이 있었다(p<0.05). 2. WST-1 검색에 의한 흡광도를 Eosin 염색 후 측정한 흡광도로 나눈 값에서도 MTT 검색과 마찬가지로 압력 저속 냉동군에서는 즉시 발치군보다 유의성 있게 세포 활성도가 낮았으나(p<0.05), 저속 냉동군이나 냉장군과 비교할때는 높은 세포 활성도를 보이며 통계적 유의성이 있었다(p<0.05). 위의 결과를 통해, 3MPa(30기압) 압력을 이용한 저속 냉동 보관법은 $4^{\circ}C$냉장법이나 압력을 사용하지 않은 다른 냉동 보관법에 비해 우수한 쥐 치아의 치주인대세포의 활성도를 보여 차후 치아의 재식/이식을 위한 중-장기 치아보관을 위한 방법으로의 가능성을 제시하였다.