단백질의 부분 가수분해는 산성 음료에서의 용해도 증가, 환자들의 소화력과 알러지 내성의 개선, 다른 기능적 특성의 개발 등을 위하여 식품산업에 널리 이용되고 있다. 그러나 우유 단백질이나 대두 단백질과 같은 몇 가지 단백질들은 가수분해에 의하여 강한 쓴맛을 형성한다, 단백질 가수분해물의 쓴맛에 관한 연구는 1950년대 초에 시작되었으며, 여러 가지 원료로부터 쓴맛물질이 분리되었다. 이들 단백질 가수분해물의 쓴맛 물질은 올리고펩타이드로 알려져 있으며, 펩타이드 분자를 구성하는 소수성 아미노산의 존재와 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 최근에 발달된 분석기술과 생명공학적 기법으로 E. coli에서 생산한 콩 단백질 단일 subunit를 이용하여 효소적 가수분해물의 분자구조를 확인하고자 하였다. 탈지대두박으로부터 115 glycinin와 E.coli떼서 발현된 proglycinin을 각각 90%, 97%의 정제도로 분리하여 이들 단백질을 trypsin으로 각각 가수분해하였다. 115 glycinin은 효소/기질 비 3%에서 4시간 가수분해에 의해 $14.0{\times}10^{-5}$ M quinine-HCI equivalent의 강한 쓴맛을 나타내었으며, 12%의 가수분해도(DH)를 나타내었다. 대두 단백질의 쓴맛 성분을 확인 위하여 이미 아미노산 서열이 밝혀진 11S glycinin과 proglycinin 가수분해물에서 GP-HPLC, $C_{18}$ RP-HPLC 등을 통하여 쓴맛 peptide들을 분리하였다. 각각의 분획은 다시 21개의 peptide로 분리되어 그 서열이 결정되었으며 이중 RP와 GI는 이미 알려진 쓴맛 dipeptide였고, LAGNQEQE, SAEFG, NALPE, KLHENIAR, GMIYPG 등이 주된 쓴맛 Peptide로 확인되었다. 이들은 11S glycinin의 5개의 subunit 중에서 그 위치가 확인되었다. Proglycinin 가수분해물에서도 11S glycinin과 같은 방법으로 7개의 쓴맛 peptide가 분리되었다. 이들은 $A_{1a}B_{1b}$의 아미노산 서열 중에서 37-42, 103-110, 164-167, 323-327, 367-373의 위치에 분포하고 있었으며, NALKPD, IYPGCPST, SlDT, HNIGQT, NAMFVPH의 서열을 나타내었다. 분리된 쓴맛 peptide 중에서 가장 쓴 두 분회의 peptide를 합성하여 관능 검사한 결과, NALPE는 매우 쓴맛을 내는 peptide로 확인되었다.

본 실험실에서는 혈당강하효과를 갖는 chiroinositol을 다량 함유하고 있는 식품이나 식용물질을 탐색하여 선발하고, 선택된 식품이나 식용물질에서 chiroinositol을 lab-scale로 분리 정제하여 제조된 chiroinositol의 추출물로 동물실험을 실시하여 혈당강하효과를 증명하고 그 기작을 연구하고 있다. 약 300여종의 식품 및 식용물질을 GC-MS 및 HPLC로 분석한 결과 식품으로 안전한 탈지대두와 두부 순물에서 chiroinositol의 함량이 각각 6.45mg/g, 20mg/g으로 조사되어 선택되었고, chiroinositol의 순도가 40-60%(w/w)인 chiroinositol의 추출물을 이용하여 동물실험을 통한 혈당강하효과를 조사한 결과, 1) steptozotocin(STZ)으로 유발된 고혈당쥐에 경구투여시, 농도 의존적으로 혈당을 감소시키는 탁월한 기능을 나타내었고, 2) 정상쥐의 혈당제거율 검사(glucose tolerance test)에서강한 제거율 및 6시간의 지속시간을 나타내었으며, 3) STZ로 유발된 고혈당쥐의 혈당제거율 검사에서 강한 혈당강하 효과(약 40%)를 나타내었으며 지속시간은 약 12시간이었다. 4) 극심한 고혈당(450 내지 500mg/d)의 경우, 경미한 고혈당(300내지 350mg/d)의 경우보다 혈당 감소율이 20% 가량 높았으며, 지속시간도 1시간 이상 긴 것으로 나타났으며, 5) 인슐린과 복합처리 했을 때 상승작용(synergy)을 나타내었으며, 저혈당증으로 전혀 발전되지 않았다.

A strain producing strongly fibrinolytic enzyme was isolated from soil and was identified to be Bacillus subtilis by biochemical and physiological characterization. The optimal culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme was determined to be 1.0% tryptone, 1.5% soluble starch, 0.5% Peptone, 0.5% NaCl, $(NH_{4})_{3}PO_4.3H_{2}O, and MgSO_{4}.7H_{2}O.$ Initial pH and temperature were pH 8.0 and $30^{\circ}C$ , respectively, The highest enzyme production was observed at 30 hours of cultivation at $30^{\circ}C$ The fibrinolytic enzyme was purified to homogeneity by DEAE Sephadex A-50 ion exchange column chromatography, 70% ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-200 and G-75 gel filtration column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was 28,000 as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. A gene encoding the fibrinolytic enzyme was cloned into a plasmid vector pBluescript, transforming E.coli XL-1 Blue. The clone was able to degrade fibrin, This indicated that the gene could encode a fibrinolytic enzyme. The nucleotide sequence of the 2.7 kb insert was determined in both direction. One open reading frame composed of 1023 nucleotides was found to be a potential protein coding region. There was the putative Shine-Dalgano sequence and TATA box upstream of the open reading frame. The homology search data in the genome database showed that both the 2.7 kb insert and 1 kb open reading frame carried no significance in the nucleotide sequence of known fibrinolytic enzyme from Bacillus serovars. The recombinant cell harboring the novel gene involved in fibrinolysis was subjected to protein purification. The molecular mass of the purified fibrinolytic enzyme was determined to be 31864 Dalton, which was highly in accordance with the molecular mass(33 kDa) of the fibrinolytic gene deduced from the insert. The fibrinolytic enzyme was Purified 50.5 folds to homogeneity in overall yield of 10.7% by DEAE Sephadex A-50 ion exchange, 85% ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-50, Superdex 75 HR FPLC gel filtration. In conclusion, a novel fibrinolytic gene from Bacillus subtilis was identified and characterized by cloning a genomic library of Bacillus subtilis into pBleuscript. For the soybean fermented by this strain, it is found that there increased assistant protein about 20% compared to the soybean not fermented and increased about 30% according to amino acid analysis and, in particular, essential amino acid increased about 40%. When keeping this fermented soybean powder at room temperature for about 70days, it showed very high stability maintaining almost perfect activity and, therefore, it gave us great suggestion its possibility of development as a new functional food.

콩관련 자연 발효식품의 기능성 증진은 품질 및 저장성을 증진시키는 방안, 자연 발효조건의 제조공정에서 발생될 수 있는 식품 안전성의 문제를 해결하기 위한 방안, 생리활성 기능을 제고하는 방안 등이 있을 수 있다. 현재까지의 국내외 연구결과는 대체로 주원료의 종류와 전처리 과정, 부원료의 첨가 및 배합비율, 발효균주의 종류와 첨가방법, 발효공정의 변화 등을 통하여 기능성 증진의 효과를 획득하는 것으로 되어 있다. 본 발표에서는 우리나라 콩 발효식품 중에서 전통메주와 검정콩 청국장에 한정하여 기능성 증진을 위한 기초적인 몇 가지의 실험결과를 발표하고자 한다.