Antibacterial Effects of Dendropanax morbifera Leaf Extracts and Fermented Sap against Oral Malodor Porphyromonas gingivalis Bacteria

구취균 Porphyromonas gingivalis에 대한 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 항균 효과

Abstract

Periodontal disease is a significant oral health issue, with halitosis-inducing bacteria being one of its primary causes. Among these bacteria, the anaerobic pathogen Porphyromonas gingivalis is known to accelerate the progression of periodontitis. Effective control and prevention of these bacteria are therefore crucial for the management and prevention of periodontal diseases. The aim of this study was to explore methods for effectively controlling halitosis-causing bacteria to enhance oral hygiene and the prevention of halitosis. We focused on Dendropanax morbifera, a traditional Korean medicinal plant known for its antimicrobial, anti-inflammatory, and antioxidant properties. Specifically, we investigated the antimicrobial effects of D. morbifera leaf extracts and fermented sap against P. gingivalis. The minimum inhibitory concentrations (MICs) and minimum bactericidal concentrations (MBCs) of the leaf extracts and fermented sap were determined under anaerobic conditions. The efficacies in reducing malodor were also evaluated using detection tubes to measure by measuring the concentrations of hydrogen sulfide (H₂S) and ammonia (NH₃) using detection tubes. Both the extracts and sap exhibited significant antimicrobial activity against P. gingivalis. Furthermore, both test materials effectively reduced bacterial production of H₂S and NH₃ gases. Field emission scanning electron microscopy observations revealed that bacterial cell wall damage began at the MIC levels, with complete cell wall destruction observed at the MBC levels. These results provide valuable data regarding the antimicrobial and halitosis-reducing effects of D. morbifera leaf extracts and fermented sap and support the potential use of D. morbifera in developing new oral hygiene products.

치주 질환은 주요 구강 건강 문제로, 그 원인 중 하나는 구취를 유발하는 세균이다. 이러한 세균 중 혐기성 병원균인 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)는 치주염의 진행을 가속화 시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 세균의 효과적인 제어와 예방은 치주 질환 관리와 예방에 필수적이다. 본 연구는 구취를 유발하는 세균을 효과적으로 제어하는 방법을 탐구하여 구강 위생과 구취 예방에 기여하고자 한다. 우리는 항균, 항염, 항산화 효과로 잘 알려진 전통 한국 약용 식물인 황칠나무(Dendropanax morbifera)에 주목하였다. 특히, 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 P. gingivalis에 미치는 항균 효과를 조사하였다. 혐기성 조건에서 잎 추출물과 수액 발효물의 최소성장억제 농도(MIC)와 최소살균농도(MBC)를 측정하였으며, 검지관을 이용하여 황화수소(H₂S)와 암모니아(NH₃) 농도를 측정하여 구취 감소 효과를 평가하였다. 실험 결과는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 P. gingivalis에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었으며, 이러한 처리가 황화수소와 암모니아 가스 생성을 효과적으로 감소시켰음을 보여주었다. 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 관찰에서는 MIC 조건에서 세포벽 손상이 시작되고 MBC 조건에서는 세포벽이 완전히 파괴됨을 확인하였다. 이러한 결과는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 강력한 항균 및 구취 감소 특성을 지니고 있음을 보여주며, 이는 향후 구강 위생 제품 개발에 있어 그 활용 가능성을 시사한다.

서론

구취균은 구강 내에서 발생하는 악취의 주요 원인 중 하나로[2, 15], 사람들에게 심리적으로 불편함을 초래할 수 있다. 이 균들은 주로 치아 표면, 잇몸, 혀 등의 부위에서 발견되며, 구취균이 생성하는 황화수소(hydrogen sulfide, H₂S)와 메틸메르캅탄(methyl mercaptan, CH₃SH) 등의 화합물은 그 특유의 악취를 초래하여 개인의 사회적 관계와 신체적 편안함에 부정적인 영향을 미칠 수 있다[4, 5, 8, 19].

구취균은 또한 다양한 치과 질환과 연관성이 있다[10, 22, 23]. 특히, Porphyromonas gingivalis는 중증 치주 질환의 시작과 진행의 주요한 원인균으로, 치주의 미세환경에서 생태적 균형을 변화시키면서 질병을 발생시킨다.

구취로 발생하는 문제를 해결하기 위해서 다양한 연구가 이루어지고 있으며[12, 17], 혀를 긁어 세척하거나 구강 세정제 등으로 해결할 수 있으나 효과가 일시적이다. 따라서 구취의 근본적인 원인인 구취균의 성장을 억제하고 사멸시키기 위한 항균 특성을 지닌 물질 개발의 필요성이 증가하고 있다.

최근, 해초(sweet laver; Eckloma cava)와 약초(lophatheri herba; Lophatherum Brongn), 편백나무(japanese cypress; Chamaecyparis obtusa)의 활성 성분으로부터 구취균 문제를 해결하고자 하는 연구가 진행되었으나, 구강청결제나 세척제가 입안에 남거나 체내로 흡수되는 문제점이 있었다. 이러한 섭취 문제를 해결하기 위해서는 안전성이 확보된 천연 제품의 사용이 주목받고 있다[7].

황칠나무는 아시아 국가에서 전통적으로 사용되어 온천연 약용 식물로, 기능성과 세포 독성 연구로 안전성이 확보된 물질이다[3, 7]. 황칠나무의 잎 추출물과 발효 수액에 대한 연구도 활발히 이루어지고 있다[7, 18]. 황칠나무의 잎 추출물은 플라보노이드, 페놀류, 테르페노이드 등의 풍부한 식물 화합물을 함유하고 있으며[1], 높은 항균 특성을 지니고 있다고 알려져 있다[11]. 황칠나무의 항균 특성에 주목하여 본 연구에서는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 구취균 P. gingivalis에 대한 항균 효과를 평가하고, 최소성장억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)와 최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC)를 특정하였다. 또한, 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 황화수소(H₂S) 및 암모니아(NH₃) 생성 억제에 미치는 영향을 확인하여 구취 성분의 직접적인 효과를 확인하였다. 그리고 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 구취균 성장에 미치는 영향과 황화수소와 암모니아의 생성 간의 상관관계를 살펴보았다. 또한, 전계 방출형 주사 전자현미경으로 균의 성장 억제뿐 아니라 세포벽을 파괴하며 사멸시키는 항균 특성을 확인하였다. 본 논문의 결과가 구강 건강 관리에 황칠나무를 소재로 한 새로운 치료 전략 개발에 기여할 것으로 기대한다.

재료 및 방법

실험 재료

구취균의 혐기배양에 필요한 TSA (tryptic soy agar) 배지, hemin, menadione, 면양적혈구, CO₂ gas pack, 그리고 anaerobic rectangular jar (135×197×95 mm)는 KisanBio (Seoul, Korea)에서 구입하였다, 황화수소와 암모니아 가스 측정을 위한 검지관은 hydrogen sulfide 4D와 ammonia 3D 타입을 Gastec Co. (Ayase, Japan)에서 구입하였다. L-cysteine은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 황칠나무 잎 및 수액은 ㈜HSP라이프(Seoul, Korea)에서 제공받았다.

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물 제조

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물은 Lee 등의 방법에 따라 제조하였다[11].

황칠나무 잎 추출물의 제조는 건조된 황칠나무 잎 30 g을 10배의 증류수 300 g과 혼합하여 90℃에서 8시간 추출하였으며, 감압 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 이후 추출물을 회전농축기(Heidolph Scientific Products GmbH, Schwabach, Germany)를 이용하여 농축한 후, 동결 건조기(EYELA, Tokyo, Japan)로 건조하여 분말 형태의 황칠나무 잎 추출물을 제조하였다.

황칠나무 수액은 기본적으로 불수용성이므로 항균 실험을 수행하기 위해서는 이를 수용성 물질로 변환시킬 필요가 있어 다음과 같은 발효 과정을 수행하였다. 멸균한 MRS 배지로 황칠나무 수액의 함량을 1.0%(w/v)로 희석하여 7×10⁸ CFU/ml의 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil 1785 (L. plantarum ilchiwhangchil 1785, KACC 92131P)를 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 진탕 배양기(shaking incubator, SH-802F, LABOTECH, Daejeon, Korea)에서 2일 동안 발효시켰다. 발효액을 원심 분리한 후, 상층액을 filtering 하여 황칠나무 수액의 발효물을 제조하였다(Fig. 1).

Fig. 1. The fermentation process of Dendropanax morbifera sap.

구취균 배양

본 연구에 사용된 그람 음성균인 구취균, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis, KCTC 5325)은 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 구입하였다. 구취균으로 사용한 혐기성 균인 P. gingivalis는 성장속도가 호기성 균에 비해 상대적으로 느리다[9]. 따라서 본 실험 전에 전 배양(pre-incubation)을 하였다. P. gingivalis를 hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), 5% 면양적혈구가 첨가된 TSA 배지(혈액한천배지)에 도말하여, CO₂ gas pack과 함께 anaerobic rectangular jar에 넣고 밀폐 후, jar를 37℃의 incubator (SH-701, LABOTECH)에서 120시간 혐기배양 하였다. 이후, 혈액한천배지에서 증식한 균주의 colony를 채취하여 hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), L-cysteine (0.5 g/l)이 첨가된 TSB (tryptic soy broth) 액체 배지에 접종 후, 37℃의 incubator에서 48시간 혐기배양 하였다.

최소성장억제 농도(MIC)와 최소살균농도(MBC) 측정

황칠나무 잎 추출물과 황칠나무 수액 발효물의 최소성장억제 농도(MIC)는 액체 배지 희석법을 이용하였으며, 균의 생장과 사멸은 UV-visible spectrophotometer (Agilent 8453, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 흡광도 값(optical density, OD)으로 확인하였다. P. gingivalis를 37℃에서 48시간 혐기배양하여 배양액의 OD_{600 nm}값이 0.1인 시료를 100배 희석하여 사용하였다. 희석된 균 현탁액 100 μl와 황칠나무 잎 추출액 또는 황칠나무 수액 발효물 100 μl를 96-plate well에 접종 후, 24시간 후의 OD_{600 nm}값의 변화를 확인하였다. 측정된 OD_{600 nm}값을 통해 P. gingivalis의 증식이 나타나지 않는 시료 농도를 MIC로 정하였다. 황칠나무 잎 추출액 또는 황칠나무 수액 발효물의 MBC는 MIC 이상에서 배양된 균 현탁액 100 μl를 혈액한천배지에 도말하여 배양기에서 37℃, 24시간 배양 후, colony가 형성되지 않는 농도로 정하였다.

구취균이 생성하는 황화수소와 암모니아의 검출

48시간 동안 혐기배양된 P. gingivalis 균 현탁액을 OD_{600 nm}값이 0.1이 되도록 희석하였다. 밀폐된 jar에서 생성되는 기체는 구취균의 농도에 의존하고, 구취균의 농도는 배지의 부피에 영향을 받는다. 예비 실험을 통해, 황화수소와 암모니아 검지관 사용에 적당한 100 ml (지름 50 mm, 높이 70 mm)의 원형 유리 비커를 선정하였다. 각 검지관의 측정 범위는 황화수소가 0‒200 ppm, 암모니아가 0‒500 ppm이다(Fig. 3). 이 비커에 hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), L-cysteine (0.5 g/l)이 첨가된 TSB 액체 배지를 70 ml 채운 후, 균 배양액을 0.7 ml 추가하여 1% 균 액을 제조하였다. 이 균 액에 황칠나무 잎 추출액 또는 황칠나무 수액 발효물을 MBC, MIC, 1/2 MIC, 1/4 MIC 농도 별로 희석하여 사용하였다. 황화수소를 측정하는 hydrogen sulfide 4D 검지관 또는 암모니아를 측정하는 ammonia 3D 검지관(Gastec Co., Kanagawa, Japan)을 각각 CO₂ gas pack과 함께 anaerobic rectangular jar에 넣고 밀폐하였다. 이후, 37℃ incubator에서 0‒72시간 동안 생성된 황화수소와 암모니아의 양을 시간 별로 확인하였다. 검지관에서 검출된 황화수소와 암모니아의 양은 단색색상분석 소프트웨어인 Image J를 이용하여 검출된 부분의 면적을 계산하여 나타내었다(Fig. 3).

FE-SEM 분석

P. gingivalis의 형태학적 변화를 전계방출형 주사 전자현미경(FE-SEM MAIA Ⅲ Triglav^TM, Tescan, Brno, Czech Republic)으로 관찰하였다. 48시간 동안 액체 배양한 P. gingivalis를 OD_{600 nm}에서 흡광도 값이 0.1인 배양액을 hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), L-cysteine (0.5 g/l)이 첨가된 TSB 액체 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 희석된 구취균의 개체 수는 1×10⁷ CFU/ml이었다. P. gingivalis 배양액에 1× MIC와 1× MBC의 황칠나무 잎 추출물(3, 6 mg/ml)과 수액 발효물(8, 16 mg/ml)로 12시간 처리하였다(Table 1) [16]. 대조군으로는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물 대신에 PBS (phosphate buffered saline)를 사용하였다. 배양 후, 10,000× g로 10분간 원심 분리한 균을 PBS로 3회 세척하여 배지를 제거한 후, 미생물의 형태를 유지하기 위해 1차 고정액으로 2.5% glutaraldehyde에 60분 incubation 한 후, PBS로 3회 씻어내어 glutaraldehyde를 제거하였다. 그다음으로, 2차 고정액으로 1% osmium tetroxide에 90분 동안 incubation 하였다. Osmium tetroxide를 제거하기 위해 washing 과정을 거치고, 탈수를 위해 에탄올 농도를 25%, 50%, 75%, 95%, 100%로 점진적으로 높여가며 각각 5분 동안 incubation 한 후, 원심 분리를 반복하였다. 마지막으로 에탄올 100%에 재현탁한 미생물을 FE-SEM 시료거치대의 carbon tape 위에 5 μl씩 drop 하여 over-night 건조시키고 진공 하에서 백금으로 스퍼터 코팅하여 관찰하였다.

Table 1. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of Dendropanax morbifera leaf extracts and fermented sap against Porphyromonas gingivalis

통계학적 분석

본 실험에서 얻은 결과는 3회 이상 반복하여 얻은 평균값을 나타내었다. 결과는 Student’s t-test를 사용하여 분석하였으며, 통계적으로 유의미한 차이를 p<0.05 기준으로 나타내었다.

결과 및 고찰

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 구취균에 대한 항균력 측정

구취균, P. gingivalis에 대한 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 MIC와 MBC를 측정하였다(Table 1). 황칠나무잎 추출물의 MIC는 3 mg/ml, MBC는 6 mg/ml로 측정되었다. 이는 황칠나무 열수추출물로 실험하여 보고된 MIC (3.13 mg/ml)와 MBC (6.25 mg/ml)와 유사한 값을 나타내었다[5]. 수액 발효물의 MIC는 8 mg/ml, MBC는 16 mg/ml로 나타났다. 따라서 황칠나무의 잎 추출물이 수액 발효물보다 MBC와 MIC 동일하게 2.67배 항균 활성이 우수함을 알 수 있다.

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 항균력은 황칠나무 잎 추출물 또는 수액 발효물과 함께 배양한 P. gingivalis를 hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), L-cysteine (0.5 g/l)이 첨가된 TSA 혈액한천배지에 도말한 다음, 형성된 colony 수를 측정하여 나타내었다(Fig. 2). 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물을 첨가하지 않은 대조군에서 P. gingivalis의 수는 4.4×10⁹ CFU/ml로 측정되었고(Fig. 2A), 이를 100%의 생존율로 나타내었다(Table 2). 잎 추출물과 수액 발효물을 1× MBC로 처리하면, P. gingivalis가 모두 사멸한 것을 확인하였다(Fig. 2E, 2I). 1× MIC에서도 P. gingivalis의 생존율이 크게 감소하였다(Fig. 2D, 2H). 1× MIC 처리 시, 잎 추출물은 균 수가 5×10⁸ CFU/ml로 대조군과 비교하여 11.3%의 생존율을, 수액 발효물의 경우, 균 수가 5.2×10⁸ CFU/ml로 대조군과 비교하여 11.8%의 생존율을 나타내었다. 즉 1× MIC 처리 조건에서 잎 추출물은 88.7%, 수액 발효물은 88.2%로 P. gingivalis의 생존율이 낮아졌다(Table 2). 더 낮은 농도인 1/2× MIC (Fig. 2C, 2G)와 1/4× MIC (Fig. 2B, 2F)에서도 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물에 의해 일정 부분 P. gingivalis의 성장 억제 효과가 있음을 알 수 있었다(Table 2).

Fig. 2. Colonies of Porphyromonas gingivalis on Tryptic Soy Agar medium supplemented with hemin (5 mg/l), menadione (0.5 mg/l), and 5% sheep blood. The control, which was not treated with Dendropanax morbifera leaf extracts and fermented sap, is represented in A. The data after treatment with Dendropanax morbifera leaf extracts and fermented sap are presented in B‒E and F‒I, respectively. The concentrations of the treated Dendropanax morbifera leaf extracts and Dendropanax morbifera fermented sap are as follows; 1/4× MIC (B, F), 1/2× MIC (C, G), 1× MIC (D, H), and 1× MBC (E, I). MIC and MBC stand for minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, respectively.

Table 2. Viable colony count of Porphyromonas gingivalis by Dendropanax morbifera leaf extracts and fermented sap

¹⁾Control: Distilled water

²⁾MIC: Minimum inhibition concentration

³⁾MBC: Minimum bactericidal concentration

구취 성분 측정

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물을 처리한 후, P. gingivalis가 생성하는 황화수소(H₂S)와 암모니아(NH₃)의 양을 검지관을 이용하여 측정하였다(Fig. 3). 구취를 유발하는 주요 기체는 주로 구강 내 세균 활동으로 생성되며, 이들 기체는 황 화합물과 아민류로 분류된다[2]. 특히 휘발성 황 화합물(volatile sulfur compounds, VSCs)이 주요 원인으로 알려져 있다. 구취 유발 기체로는 황화수소와 암모니아 이외에도 메틸메르캅탄(methyl mercaptan, CH₃SH), 디메틸설파이드(dimethyl sulfide, (CH₃)₂S), 트리메틸아민(trimethylamine, (CH₃)₃N)), 인돌(indole), 그리고 스카톨(skatole) 등이 알려져 있다[15]. 본 연구에서는 구취의 주된 원인으로 확인된 황화수소와 암모니아를 선택하여 측정하였다. 이 두 기체는 구강 내 혐기성 세균이 단백질을 분해할 때 생성되며, 매우 낮은 농도에서도 강한 악취를 일으킬 수 있다. 또한 이 두 기체의 측정은 시판되는 검지관을 이용할 수 있다는 장점이 있다. 예시로 황칠나무 잎추출물과(Fig. 3A) 수액 발효물을(Fig. 3C) 72시간 처리한 후에 검출된 황화수소와 암모니아 기체의 검출량을 나타내고 있다. 대조군의 검출면적을 100%로 계산하였고 1× MBC 농도 처리 후의 검출면적은 0으로 나타났다. 각 시료에서 검출된 두 기체의 상대면적을 Image J 소프트웨어로 분석하였다(Fig. 3B, 3D).

Fig. 3. Hydrogen sulfide detection and ammonia detection from Gastec Co. The sample tube was cut on the left end to facilitate gas measurement through the observation of color changes within the tube. The capital 'G' in the sample tube indicates the inflow of gas. Hydrogen sulfide turns black after detection, while ammonia changes to yellow. The maximum detection area (control) of each detection tube was represented as 100%, and the relative area of each detection tube was analyzed using Image J software. The raw detection tube data and analyzed graph from the treatment with Dendropanax morbifera leaf extracts are presented in A and B, respectively. While the raw data and analyzed graph from the treatment with Dendropanax morbifera fermented sap are shown in C and D, respectively. MIC and MBC stand for minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, respectively.

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물을 첨가하지 않은 대조군에서는 시간이 지남에 따라 P. gingivalis에 의해 생성된 황화수소와 암모니아의 농도가 모두 증가하는 경향을 나타냈다(Fig. 4). 반면, 황칠나무 잎 추출물과(Fig. 4A, 4C) 수액 발효물을(Fig. 4B, 4D) 처리한 군에서는 두 기체의 생성이 현저히 감소하였다. 특히, 1× MBC의 잎 추출물과 수액 발효물 처리군 모두에서 황화수소와 암모니아 가스가 생성이 모두 0%로 나타났다. 이는 P. gingivalis가 모두 사멸한 것을 반영하며 본 실험에서 측정한 두 기체는 모두 P. gingivalis의 대사 과정에서 기인함을 나타내고 있다. 또한 Image J를 이용하여 각 기체의 면적을 측정하였을 때 잎 추출물 1× MIC로 처리한 시료에서는 황화수소 14.2%, 암모니아 13.4%로 측정되어, 대조군 대비 약 85% 이상의 황화수소와 암모니아의 생성이 감소하였다(Table 3). 1/2× MIC에서는 대조군 대비 약 70%, 1/4× MIC에서는 대조군 대비 약 50%의 황화수소와 암모니아가 감소하였다(Table 3). 수액 발효물 처리군에서도 잎 추출물 처리의 경우와 유사한 결과가 나타났다(Fig. 4B, 4D). 1× MIC에서는 대조군 대비 약 85% 이상 감소, 1/2× MIC과 1/4× MIC 처리 경우는 각각 70%, 50% 감소하였다(Table 3).

Fig. 4. Gas production changes of hydrogen sulfide (A and B) and ammonia (C and D), which were detected in Porphyromonas gingivalis over incubation time. The data after treatment with Dendropanax morbifera leaf extracts are shown in A and C, while the data after treatment with Dendropanax morbifera fermented sap are shown in B and D. MIC and MBC stand for minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, respectively.

Table 3. Gas production ratio (%) of hydrogen sulfide (H₂S) and ammonia (NH₃) by Dendropanax morbifera leaf extracts and fermented sap

¹⁾Control: Distilled water

²⁾MIC: Minimum inhibition concentration

³⁾MBC: Minimum bactericidal concentration

황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물 처리를 한 P. gingivalis의 생존율 실험 결과와 검지관을 이용한 황화수소와 암모니아 검출 결과가 매우 유사함을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 본 실험 결과, P. gingivalis 균 수의 변화와 구취의 원인 물질인 황화수소와 암모니아의 생성의 변화가 직접적으로 관련이 있음을 확인하였고, P. gingivalis의 대사과정을 억제하여 구취를 유발하는 주요 기체의 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 알았다. 이는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 구취균에 대해 효과적인 천연 항균제로서의 잠재력을 가지고 있으며, 구취 제거 및 구강 건강 증진을 위한 다양한 응용 가능성이 있음을 시사한다. 따라서 향후 연구에서는 구취균 항균 활성 성분을 동정하고 그 성분들의 정확한 작용 메커니즘을 규명하는 것과 잎 추출물과 수액 발효물의 최적의 농도 조합을 도출하여 상용화 가능성을 높이는 데 중점을 둘 필요가 있다.

Fig. 5. Comparison of the effects of Dendropanax morbifera leaf extract (A) and fermented sap (B) on the growth of Porphyromonas gingivalis and the production of hydrogen sulfide and ammonia gases. MIC and MBC stand for minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, respectively.

항균 효과의 FE-SEM 관찰

P. gingivalis의 형태 변화를 관찰하기 위해 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물을 처리한 후, 전계방출형 주사 전자현미경으로 관찰하였다(Fig. 6). P. gingivalis는 일반적으로 직경이 약 0.5‒2.0 μm의 구균 형태(타원형 또는 약간 길쭉한 형태)이다[13, 21]. 잎 추출물과 수액 발효물로 처리하지 않은 대조군에서는 P. gingivalis가 일정한 크기와 모양을 유지하며 완전한 세포 구조를 나타내었다(Fig. 6A). 그러나 1× MIC 조건에서 황칠나무 잎 추출물과(Fig. 6B) 수액 발효물을(Fig. 6C) 처리한 P. gingivalis는 노란색 화살표로 표시한 부분에서 표면이 주름지고 불규칙적으로 변형되어 손상된 세포벽의 모습을 보였다. 더욱이 1× MBC 잎 추출물과(Fig. 6D) 수액 발효물을(Fig. 6E) 처리한 경우 모두 P. gingivalis의 세포벽이 완전히 융해된 모습을 확인할 수 있었다. 이는 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물이 P. gingivalis의 세포벽과 막에 손상을 유발한다는 것을 시사한다. FE-SEM 관찰로, 잎 추출물과 수액 발효물의 항균 활성은 균 성장을 억제시키는 효과뿐만 아니라 균 세포를 사멸시키는 항균 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 6. FE-SEM images of Porphyromonas gingivalis. Control is shown in A. The image after treatment with Dendropanax morbifera leaf extracts are shown in B and D, while the image after treatment with Dendropanax morbifera fermented sap are shown in C and E. The concentrations of treated with leaf extracts and fermented sap are MIC (B, C) and MBC (D, E), respectively. Yellow arrows indicate the damaged cells. The images exhibit 50 kx (A‒C) and 30 kx (D and E), respectively. MIC and MBC stand for minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, respectively.

P. gingivalis를 비롯한 구강 혐기성 세균들이 생성하는 황화수소와 치주염과 관계가 보고되어 있으며[20] 구취균들은 치은 상피 세포를 포함한 치주 조직 내 세포들의세포사멸을 유도할 수 있다고 알려졌다[14]. P. gingivalis가 생성하는 암모니아는 치주 조직에 쉽게 침투하고 낮은 농도에서도 숙주 세포 활동과 숙주 방어시스템을 교란시킨다는 보고도 있다[14]. 이렇게 구취균은 냄새 유발뿐 아니라 구강 건강, 면역까지 깊은 관계가 있다. 본 실험 결과를 종합하면, 황칠나무 잎 추출물과 수액 발효물의 활성 성분들이 P. gingivalis의 세포벽과 세포막에 손상을 일으켜, 세포 내 효소의 활성을 저해하고, 세균의 단백질 합성 및 DNA 복제 과정을 방해하여 세균의 증식을 억제하고, 궁극적으로 구취를 유발하는 기체의 생성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

감사의 글

이 연구는 국립금오공과대학교 대학 연구과제비로 지원되었음(2022‒2024).

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.