Korean Journal of Clinical Laboratory Science (대한임상검사과학회지)

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A Study on the Stainability and DNA Conservation of Tissue Slides according to Fixation Time and Temperature

고정시간과 온도에 따른 조직 슬라이드의 염색성 및 DNA 보존성 연구

  • Da-som JEONG (Pathology Laboratory, Seoul National University Hospital)
  • 정다솜 (서울대학교병원 병리검사실)
  • Received : 2024.05.14
  • Accepted : 2024.07.09
  • Published : 2024.09.30
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Abstract

In this paper, the factors affecting tissues during fixation on slides were determined by changing the tissue type, fixation time, and temperature. Also, stainability and DNA conservation were evaluated. The tissues selected were parenchymal and intestinal tissue. The stainability was evaluated using hematoxylin and eosin staining and a special stain suitable for the tissue. DNA conservation was evaluated using the DNA integrity number (DIN) for stability evaluation after purity measurement. The results showed that, at all temperatures, as time increased, there was no histomorphological difference and the stainability tended to intensify. The intestinal tissue tended to have less mucosal change and proper muscle layer degeneration. There was little difference in the purity. However, the longer the fixation time, the lower the DIN value for DNA. Significant differences were identified at 25℃ and 50℃. This means that fixation at 4℃ is the more safe for DNA. This experiment confirmed that, between the time and temperature conditions associated with fixation, time had a greater effect on both staining and DNA conservation. The results of this study are expected to provide basic data for future research on the setting appropriate conditions for fixation for histopathological examinations or diagnoses.

병리과의 조직병리검사에서 진단까지의 과정 중 가장 초기단계이자 기본이 되는 과정은 고정이다. 고정은 진단을 위해 생체로부터 떼어낸 조직을 생체와 같은 구조로 유지하기 위해 실행하는 과정이다. 고정에는 영향을 미치는 여러 가지 요인이 있다. 조직의 종류에 따른 특성, 고정의 시간, 온도, pH 등이 이에 해당한다. 따라서 본 논문에서는 이러한 요인들 중 조직 종류, 시간과 온도에 변화를 주어 고정을 진행하고, 각 조건에 따른 염색성과 DNA 보존성을 평가하여 고정의 조건이 검사에 어떠한 영향을 미치며 어떠한 인자의 영향이 더 큰지 확인해 보고자 시행하였다. 고정은 4℃ (냉장), 25℃ (실온), 50℃ (oven)에서 각각 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 그리고 24시간 진행하였고 24시간은 과고정 상태를 확인하기 위해 설정하였다. 조직의 종류는 특성에 따라 실질장기와 점막층을 포함하고 있는 장관조직으로 선정하였다. 실질장기로는 liver를 장관조직에는 colon과 small intestine을 함께 사용하였다. 염색성 H&E 염색과 각 장기의 특성에 맞는 특수염색을 종합하여 평가하였다. 특수염색으로 liver는 reticulin 염색, intestine은 periodic-acid-Schiff (PAS) 염색을 시행하였으며 liver의 조직형태학적 변화와 염색성, 장관조직의 mucosal change, proper muscle layer degeneration으로 염색성을 확인하였다. DNA 보존성 평가는 DNA purity 측정 후 안정성 확인을 위해 DNA integrity number (DIN)를 평가하였다. 그 결과 염색성 평가의 경우 liver는 현미경하에서 조직형태학적 차이는 관찰되지 않았으며, 모든 온도에서 시간이 길수록 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. Intestine은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 mucosal change, proper muscle layer degeneration의 정도가 적었으며, PAS 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. DNA 보존성 평가는 liver의 경우 purity의 차이는 거의 없었으며 DIN 값은 모든 온도에서 가장 오랜 시간 고정한 조건에서 가장 낮은 값을 나타냈다. Intestine은 purity의 차이는 거의 없었으며 DIN 값은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 낮아졌다. 유의한 차이는 25℃와 50℃에서 확인되었다. 이는 4℃에서 DNA가 가장 안전하게 고정됨을 의미한다. 본 실험을 통해 고정은 염색성과 DNA 보존성 모두에서 시간과 온도조건 중 시간의 영향이 더 있음을 확인할 수 있었고, 점막을 포함하고 있는 조직이 고정조건에 더 민감하며, 4℃에서 DNA가 안정하게 고정되는 것으로 평가되었다. 추후 고정조건을 추가적으로 설정하고 한계점을 보완하여 연구를 진행한다면, 본 연구 결과는 향후 조직병리검사의 목적이나 진단을 위한 고정조건설정에 관한 연구에 기초적인 자료로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Keywords

Acknowledgement

This article is a condensed form of the first author's master's thesis from Korea University.

References

  1. Marchevsky AM, Wick MR. Evidence-based medicine, medical decision analysis, and pathology. Hum Pathol. 2004;35:1179-1188. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2004.06.004 
  2. Bock O. A history of the development of histology up to the end of the nineteenth century. Research: 2015. 
  3. Comanescu M, Arsene D, Ardeleanu C, Bussolati G. The mandate for a proper preservation in histopathological tissues. Rom J Morphol Embryol. 2012;53:233-242. 
  4. Kim HG. Histochemical study of mucin composition of gastric cancer and surrounding mucosa. J Pathol Transl Med. 1983;17:391-398. 
  5. Na JG, Hwang YH, Choi KP. A clinical study of colorectal cancer. J Korean Surg Soc. 1997;53:676-688. 
  6. Grizzle WE. Special symposium: fixation and tissue processing models. Biotech Histochem. 2009;84:185-193. https://doi.org/10.3109/10520290903039052 
  7. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 2001;24:173-190. https://doi.org/10.1179/his.2001.24.3.173 
  8. Ganjali H, Ganjali M. Fixation in tissue processing. Int J Farming Allied Sci. 2013;2:686-689. 
  9. Baloglu G, Haholu A, Kucukodaci Z, Yilmaz I, Yildirim S, Baloglu H. The effects of tissue fixation alternatives on DNA content: a study on normal colon tissue. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2008;16:485-492. https://doi.org/10.1097/pai.0b013e31815dffa6 
  10. Nam SK, Im J, Kwak Y, Han N, Nam KH, Seo AN, et al. Effects of Fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48:36-42. 
  11. Neumeister VM, Anagnostou V, Siddiqui S, England AM, Zarrella ER, Vassilakopoulou M, et al. Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst. 2012;104:1815-1824. https://doi.org/10.1093/jnci/djs438 
  12. Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 2000;24:1016-1019. https://doi.org/10.1097/00000478-200007000-00014 
  13. Rolls G. Process of fixation and the nature of fixatives [Internet]. Leica Biosystems [cited 2022 February]. Available from: https://www.leicabiosystems.com/en-kr/knowledge-pathway/fixation-and-fixatives-1-the-process-of-fixation-and-the-nature-of-fixatives/ 
  14. Fox CH, Johnson FB, Whiting J, Roller PP. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 1985;33:845-853. https://doi.org/10.1177/33.8.3894502 
  15. Thavarajah R, Mudimbaimannar VK, Elizabeth J, Rao UK, Ranganathan K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 2012;16:400-405. https://doi.org/10.4103/0973-029x.102496 
  16. Sung HW, Chang Y, Liang IL, Chang WH, Chen YC. Fixation of biological tissues with a naturally occurring crosslinking agent: fixation rate and effects of pH, temperature, and initial fixative concentration. J Biomed Mater Res. 2000;52:77-87. https://doi.org/10.1002/1097-4636(200010)52:1%3C77::aid-jbm10%3E3.0.co;2-6 
  17. Buesa RJ. Histology without formalin? Ann Diagn Pathol. 2008;12:387-396. https://doi.org/10.1016/j.anndiagpath.2008.07.004 
  18. Salvi M, Molinari F. Multi-tissue and multi-scale approach for nuclei segmentation in H&E stained images. Biomed Eng Online. 2018;17:89. https://doi.org/10.1186/s12938-018-0518-0 
  19. de Haan K, Zhang Y, Zuckerman JE, Liu T, Sisk AE, Diaz MFP, et al. Deep learning-based transformation of H&E stained tissues into special stains. Nat Commun. 2021;12:4884. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25221-2 
  20. Krishna M. Role of special stains in diagnostic liver pathology. Clin Liver Dis (Hoboken). 2013;2:S8-S10. https://doi.org/10.1002/cld.148 
  21. Lim DJ, Shimada T, Yoder M. Distribution of mucus-secreting cells in normal middle ear mucosa. Arch Otolaryngol. 1973;98:2-9. https://doi.org/10.1001/archotol.1973.00780020006002 
  22. Bussolati G, Annaratone L, Medico E, D'Armento G, Sapino A. Formalin fixation at low temperature better preserves nucleic acid integrity. PLoS One. 2011;6:e21043. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0021043 
  23. Buesa RJ, Peshkov MV. How much formalinis enough to fix tissues? Ann Diagn Pathol. 2012;16:202-209. https://doi.org/10.1016/j.anndiagpath.2011.12.003