뱀장어(Anguilla japonica)용 사료 기능성 첨가제로써의 발효 혈분 이용성 평가

Evaluation of Fermented Blood Meal as a Functional Additive in the Diet of Japanese Eel Anguilla japonica

Abstract

The effects of dietary supplementation with fermented blood meal (FBM) in two forms were evaluated on the growth performance, hematological parameters, innate immune response, antioxidant capacity, digestive enzyme activity and intestinal histology of Japanese eel Anguilla japonica. A commercial powder feed was used as a basal diet (Con). Six other diets were prepared by supplementing 2, 4 and 6% FBM either in powder or liquid form to the Con diet (designated as P2, P4, P6, L2, L4 and L6, respectively). In total 420 eels (initial mean body weight: 55.1±1.71 g) were distributed into 21 tanks (450L) at a density of 20 eels per tank. Three replicate groups of fish were fed one of the seven diets twice daily for 12 weeks. No significant differences were observed in the growth performance and survival among all groups. Fish fed FBM-containing diets showed significantly improved hematological parameters, innate immunity and antioxidant capacity than those in the Con group. Fish fed FBM-containing diets showed significantly enhanced digestive enzyme activity, villus length and goblet cells than those in fish fed Con diet. These results indicate that both powder and liquid FBM could be a good functional feed additive to improve innate immunity and digestion in Japanese eel.

서론

혈분은 축산 산업에서 발생하는 동물성 부산물인 혈액을 건조한 것으로, 폐기물을 재활용하여 단백질원으로 이용하기 때문에 양식사료에서 친환경적인 원료로 각광받고 있다(Zheng et al., 2014). 혈분은 조단백질 함량(85–95%)이 높고 lysine, valine, leucine과 같은 아미노산이 풍부하여 양식사료에 단백질원으로써 이용성이 높다고 평가되고 있다(National Research Council, 2012). 또한, 헤모글로빈과 생체 이용률이 높은 hemeFe과 아연, 구리를 포함하여 필수 미네랄의 좋은 공급원으로 알려져 있다(Zheng et al., 2014). 혈분에 풍부하게 함유된 헤모글로빈은 항균 펩타이드로써 기능하며, 항균, 항산화 활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Nedjar-Arroume et al., 2008). 나일틸라피아(Oreochromis niloticus) (Ambreen et al., 2023), gilthead seabream Sparus aurata (Gisbert et al., 2015), African catfish Clarias gariepinus (Ogunji et al., 2020) 사료에 혈분을 첨가하였을 때, 성장을 증진시키는 효과가 있다고 보고되었다. S. aurata 사료 내 혈분 첨가는 lysozyme 활성, 식세포 작용과 같은 선천성 면역력을 높였다고 보고되었다(Gisbert et al., 2015). 이에 더해, S. aurata 사료 내 혈분의 첨가는 장 기능 향상과 장내 염증 반응을 억제하는 효과가 있다고 보고되었다(Gisbert et al., 2015). 그러나, 혈분은 arginine, methionine, isoleucine 같은 일부 필수 아미노산이 부족하여 사료에 혈분을 단백질원으로써 다량으로 사용했을 때 필수 아미노산의 결핍에 따른 결핍증으로, 단백질 소화율이 저하되어 Rohu Labeo rohita와 O. niloticus의 성장과 사료 기호성, 소화율, 선천성 면역력이 감소되는 것으로 보고되었다(Hussain et al., 2011; Kirimi et al., 2017). 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 혈분을 발효시키는 방법이 주목받고 있다(He, 2008; Zheng et al., 2014).

발효 혈분(fermented blood meal, FBM)은 유산균을 이용하여 혈분을 발효시킨 것으로, 혈분의 문제점인 아미노산 불균형과 낮은 기호성을 보완하고 단백질을 더 작은 펩타이드나 유리 아미노산으로 분해하여 소화율을 개선시키는 것으로 알려져 있다(He, 2008; Zheng et al., 2014). 이에 더해 발효는 비타민, 탄수화물, 칼슘의 소화율을 증가시킬 수 있으며, 발효에 사용된 미생물은 probiotic으로써 기능을 함으로써 수생 동물에서 사료의 소화율을 높이는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있다(Dawood and Koshio, 2020). FBM은 단백질, 필수 아미노산, 미네랄의 풍부한 공급원이며, 영양소 흡수율이 발효하지 않은 혈분에 비해 높은 것으로 알려져 있다(Chen et al., 2013). FBM을 이용하여 silver pompano Trachinotus blochii 사료 내 어분을 대체하였을 때, 발효하지 않은 혈분으로 대체했을 때 보다 성장이 더 좋았던 것으로 보고되었다(Hamed et al., 2017). 양식사료 내 FBM의 이용성을 평가한 연구는 매우 제한적이며, 원료 또는 첨가제로써 이용하기 위해서는 연구가 필요한 실정이다.

극동산 뱀장어(Anguilla japonica)는 한국, 일본, 중국과 같은 동아시아 국가에서 경제적으로 중요한 양식 어종으로 높은 시장 수요와 가격으로 인해 고부가가치의 어종으로 평가받고 있다(Hamidoghli et al., 2019). 뱀장어 양식은 단위면적당 생산량을 높이기 위해 한정된 공간에서 고밀도로 사육하는 경우가 많으며 주로 콘크리트 수조에서 지수식으로 양식한다. 이러한 뱀장어 양식 방법은 고밀도 사육과 반죽사료의 공급으로 인해 수질이 쉽게 악화되며, 이에 따른 병원성 미생물과 바이러스 감염으로 인한 막대한 경제적 피해가 발생하고 있다(Lim et al., 2015). 전염성 질병의 발생을 줄이고 양식 뱀장어의 전반적인 건강을 증진시키기 위해 선천성 면역반응을 향상시킬 수 있는 사료 첨가제 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 따라서, 본 연구는 사료 내 FBM의 첨가가 뱀장어의 성장과 선천성 면역력, 항산화 활성, 소화효소 활성 및 조직학적 변화에 미치는 영향을 조사하여 동물성 부산물인 혈분을 뱀장어 사료 내 면역증강제로써 활용할 수 있는지 평가하기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

실험사료

사육실험에 사용된 FBM은 porcine 혈액을 발효시킨 것으로 (주)삼다(Jeju, Korea)에서 제공받았다. FBM은 당일 채집한 porcine 혈액을 이용하여 제작하였다. 혈액 총량의 1.5%에 해당하는 단백가수분해효소를 첨가하여 가수분해한 후, 알칼리아제(Novozyme, Copenhagen, Denmark)를 투여하였다. 혼합물의 총 중량을 기준으로 당(설탕) 8%, 유산균 배양액 6%를 투입한 후 30°C, 50 rpm으로 3일간 발효하였으며, 건조하여 사용하였다. FBM의 조단백질은 건물함량 기준 분말(powder) 62.5%, 액상(liquid) 55.3%, 조지질은 분말 5.5%, 액상 7.6%로 조성되었으며, 상업사료의 조단백질은 54.6% 조지질은 8.7%로 조성되었다. 대조사료는 상업사료(KOFEC, Naju, Korea)를 사용하였다. 실험사료는 총 6종으로, 대조사료 내 FBM 분말과 액상을 각각 2, 4, 6% 첨가하였다(P2, P4, P6, L2, L4, L6). 실험사료는 분말과 액상 형태의 FBM을 각각 대조사료를 대체하여 혼합한 후 -20°C에 보관하였다. 사료는 급여 직전에 사료원료 총 중량의 110%에 해당하는 증류수를 실험사료 혼합물에 첨가하여 반죽사료를 제작하였으며, 만복 공급하였다. 실험사료의 일반성분 조성은 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Dietary formulation (g/kg, wet basis), proximate composition (%, dry matter basis) and essential amino acid composition (%, dry matter basis) of the experimental diets for the feeding trial of Japanese eel Anguilla japonica

¹ Feeds was supplied as extrude powder, KOFEC Ltd. Co. Naju, Korea. ² Fermented blood meal as powder, Samda Ltd. Co. Jeju, Korea. ³ Fermented blood meal as liquid, Samda Ltd. Co. Jeju, Korea. Values are mean of triplicate (n=3) and presented as mean±S.D.

실험어류와 사육관리

사육실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 윤리규정(2023-0013)을 준수하며 진행되었다. 뱀장어는 전라남도 함평군에 위치한 해정수산에서 구입하였다. 뱀장어는 대조사료를 공급하며, 4주간 사육실험 환경에 순치시켰다. 예비 사육 후, 총 420마리의 뱀장어(초기평균무게, 55.1±1.71 g)를 21개의 acrylonitrile butadiene styrene (ABS) 원형수조(450 L)에 수조 당 20마리씩 3 반복으로 무작위 배치하였다. 실험사료는 1일 2회(07:00, 19:00 h)에 걸쳐 12주동안 공급하였다. 수조의 용존산소(dissolved oxygen, DO)를 유지하기 위해 공기발생기(aeration)를 설치하였다. 광주기는 형광등을 이용하여 12 light: 12 dark로 유지되었다. 사육실험 동안 각 수조의 수온과 DO를 매일 측정하였으며, pH와 암모니아(ammonia; NH₃)농도는 매주 1회 측정하였다. DO는 Pro20 Dissolved Oxygen Instrument (YSI, Yellow Springs, OH, USA), pH는 Seven Compact (METTLER TOLEDO, Columbus, OH, USA) 기기를 사용하여 측정하였다. 사육실험기간 중 평균 수온은 28.0±0.6°C, DO는 5.98±0.33 mg/L, pH는 4.92±0.18 범위로 유지되었다.

Sampling

사육실험 종료 후, 성장률(weight gain, WG)과 일간성장률(specific growth rate, SGR), 사료계수(feed conversion ratio, FCR), 생존율(survival)을 측정하기 위해 샘플링 수행 24시간 전부터 실험어를 절식하였다. 비만도(condition factor, CF)와 간중량지수(hepatosomatic index, HSI)를 측정하기 위해 수조당 6마리씩 무작위로 선정하여 전장과 전어체 무게, 간 무게를 측정하였다.

모든 실험어의 최종 무게측정 후, 수조 당 6 마리(실험구 당18마리)의 뱀장어를 무작위로 선별하여 120 ppm의 2-phenoxy-ethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액으로 마취시킨 후, 주사기를 사용하여 미부동맥에서 전혈(whole-blood)을 채취하였다. 6마리 중 3마리의 전혈은 20 μL의 heparin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 처리하여 hemoglobin, hematocrit을 분석하는데 사용하였다. 혈장(plasma)은 전혈을 원심분리(5,000 g, 10 min, 4°C)하였으며, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT)를 측정하는데 사용하였다. 혈청(serum)은 25°C에서 30분 동안 응고시켜 원심분리(5,000 g, 10 min, 4°C)하였으며, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total immunoglobulin (Ig)를 측정 하는데사용하였다. 혈장과 혈청은 선천성 면역력과 항산화 분석에 사용할 때까지 냉동(-80°C) 보관하였다.

채혈이 끝난 후, 수조 당 3마리의 뱀장어에서 간(liver)과 장(intestine)을 적출하였다. 간은 무게측정 후, 소화효소 분석과 malondialdehyde (MDA) 분석을 위해 액체질소를 이용하여 급속 냉동한 다음 냉동(-80°C)보관하였으며, 24시간 이내에 분석하였다. 전장(anterior intestine)은 조직학적 분석을 위해 10% formalin에 고정시킨 후 분석 전까지 보관하였다.

분석 방법

실험사료의 일반성분 분석은 AOAC (2005) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법을 이용하여 125°C에서 3시간 동안 시료를 건조시켜 측정하였으며, 회분은 직접회화법을 이용하여 550°C에서 4시간 동안 시료를 가열하여 측정하였다. 조단백질은 자동조단백질분석기(Kjeltec^TM 2300; FOSS Analytical, Hillerød, Denmark)로 분석하였으며, 조지질은 Soxhlet 추출 장치(SOX406; Hanon, Jinan, China)를 이용하여 분석하였다.

실험사료의 아미노산 분석은 Ding et al. (2023) 방법에 따라 high-performance liquid chromatography (HPLC)로 분석되었다. 각각의 실험사료 50 mg을 계량하여 micro tube에 담고 증류수 1 mL을 첨가하여 균질한 후, 초음파 추출기(JAC-1505; KODO, Hwaseong, Korea)를 이용하여 30분간 추출한다. 추출물은 원심분리(14,000 g, 10 min, 4°C)하여 상층액을 분석에 사용하였다. 분리된 상층액에 12 mol/L HCl 120 μL를 가하여 heating block에서 150°C, 1시간 동안 가수분해하고 질소(N₂) 가스로 충전시켜 건조하였다. 이후 건조된 시료에 증류수 1 mL을 가한 후, 시료 200 μL에 0.1 mol/L phenyl isothiocyanate (PITC) 100 μL, 1.0 mol/L triethylamine (TEA) 100 μL를 가하여 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 이후, 증류수 600 μL와 hexane 1000 μL를 가하여 원심분리 한 후 하층액을 수집하여 syringe filter (0.45 μm)로 여과한 후 이 여액을 20 μL 취해 HPLC (Breeze QS HPLC; Waters Corporation, Milford, MA, USA)에 주입하여 분석하였다. HPLC 분석조건은 C18 column (Poroshell 120 L1, Agilent, 4.6×100 mm, 5 μm)을 사용하였으며, column 온도는 36°C, 유속은 1.0 mL/min, 검출기는 UV/Visible 검출기(Waters 2489; Waters Corporation)로 분석되었다. 이동상의 조성과 구배는 Ding et al. (2023)에 방법으로 분석하였다. 혈액의 hemoglobin, AST, ALT는 혈액 생화학 분석기(CH 100^plus; RADIM Company, Firenze, Italy)를 사용하여 분석하였다. Hematocrit은 micro-hematocrit (VS-12000; Vision Scientific, Daejeon, Korea)를 이용하여 측정하였다. MPO, Ig, lysozyme은 각각 Quade and Roth (1997), Anderson and Siwicki (1995), Hultmark et al. (1980) 방법을 기초로 분석되었다. SOD는 DG-SOD400 (DoGenBio, Seoul, Korea), CAT는 DG-CAT400 (DoGenBio), MDA 활성은 K379-100 (Bio-vision, Inc., Milpitas, CA, USA) kit를 사용하여 분석하였다.

실험어의 소화효소 활성을 조사하기 위해 간 30 mg과 증류수 1.5 mL을 혼합하여 균질하였다. 혼합물은 원심분리(15,000 g, 15 min, 4°C) 후, 상층액을 분리하여, 분석에 사용하였다. 각 시료의 단백질 함량은 상업용 kit (Protein Assay kit II; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. Trypsin과 chymotrypsin, lipase의 활성도는 Natalia et al. (2004)의 방법을 기초로 분석하였다. 10% formalin으로 고정된 장은 tissue processor (TP1020; Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 탈수되었다. 탈수 후, sample을 paraffin에 포매하고 6 μm 너비로 절편하여 유리 슬라이드에 놓아 고정한 후, Periodic acid-Schiff (PAS) 방법으로 염색하였다(Fig. 1). 염색된 sample은 광학현미경(ICC50; Leica)을 이용하여 장의 융모 길이(villus length)와 배상세포(goblet cells) 수를 측정하였다.

Fig. 1. Histological results for intestine of Japanese eel Anguilla japonica fed the experimental diets for 12 weeks. a, Villus length (μm); b, Goblet cells. PAS-stained intestine tissue section at 100×magnification, scale bar=200 µm.

통계학적 분석

실험 수조의 배치는 완전확률계획법(completely randomized design)을 이용하였다. 실험의 결과는 SPSS (Version 24.0; International Business Machines Co., New York, NY, USA)를 이용하여 One-way ANOVA 방법으로 통계 분석되었다. 각 항목의 결과는 Duncan’s multiple test (P≤0.05)를 이용하여 유의성을 검증하였고, 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 통계 분석하였다. Two-way ANOVA 방법을 이용하여 FBM의 형태(type)와 첨가율(inclusion ratio) 사이의 관계를 통계 분석하였다.

결과

WG, SGR, FCR, CF, HSI와 생존율은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이가 없었다(Table 2). 혈액 내 hemoglobin, hematocrit과 AST는 모든 실험구에서 유의적인 차이가 없었다(Table 3). ALT는 P2구를 제외한 모든 FBM 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다. MPO 활성은 L6 구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(Table 4). Lysozyme 활성은 P4 구를 제외한 모든 FBM 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. Ig는 P4와 L4 구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. SOD 활성은 P6와 L4 구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. CAT 활성은 모든 실험구에서 유의적인 차이가 없었다. MDA는 모든 FBM 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다. 소화효소 활성 분석 결과, trypsin 활성은 P6구와 L2구를 제외한 모든 FBM 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 높았으며, chymotrypsin 활성은 L4와 L6 구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(Fig. 2). Lipase 활성은 P4, L6 구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. 조직 분석 결과, villus length는 P2, P6, L6 구가 대조구에 비해 유의적으로 증가했으며, goblet cells은 L2 구가 대조구에 비해 유의적으로 증가하였다(Fig. 3).

Table 2. Growth and biological assessment of Japanese eel Anguilla japonica (initial body weight, 55.1±1.71 g) fed experimental diets for 12 weeks

¹ Weight gain (%) = [(final body weight−initial body weight)/initial body weight]×100. ² Specific growth rate (%) = [(log_e final body weight−log_e initial body weight)/days]×100. ³ Feed conversion ratio = dry feed fed (g) / wet weight gain (g). ⁴ Condition factor = [body weight (g)/{body length (cm)}³]×100. ⁵ Hepatosomatic index (%) = [liver weight (g) /fish weight (g)]×100. The experimental diets were added with fermented blood meal powder and liquid at each level, respectively (Con, P2, P4, P6, L2, L4 and L6). Values are mean of triplicate (n=3) and presented as mean±S.D.

Fig. 2. Digestive enzyme activity of Japanese eel Anguilla japonica (initial mean body weight, 55.1±1.71 g) fed experimental diets for 12 weeks. ¹ Trypsin activity (mU/mg per protein). ² Chymotrypsin activity (mU/mg per protein). ³ Lipase activity (mU/mg per protein). The experimental diets were added with fermented blood meal powder and liquid at each level, respectively (Con, P2, P4, P6, L2, L4 and L6). Bars with different letters are significantly different (P<0.05)

Table 3. Hematological parameters of Japanese eel Anguilla japonica (initial mean body weight, 55.1±1.71 g) fed experimental diets for 12 weeks

¹ Hemoglobin (mg/dL). ² Hematocrit (%). ³ Aspartate aminotransferase (U/L). 4 Alanine aminotransferase (U/L). The experimental diets were added with fermented blood meal powder and liquid at each level, respectively (Con, P2, P4, P6, L2, L4 and L6). Values are mean of triplicate (n=3) and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

Fig. 3. Villus length and goblet cells of Japanese eel Anguilla japonica fed experimental diets for 12 weeks. ¹ Villus length (μm). ² Goblet cells = average number of cells. The experimental diets were added with fermented blood meal powder and liquid at each level, respectively (Con, P2, P4, P6, L2, L4 and L6). Bars with different letters are significantly different (P<0.05).

Table 4. Innate immune responses and antioxidant capacity of Japanese eel Anguilla japonica (initial mean body weight, 55.1±1.71 g) fed experimental diets for 12 weeks

¹ Myeloperoxidase (absorbance). ² Lysozyme activity (μg/mL). ³ Total immunoglobulin (mg/mL). ⁴ Superoxide dismutase (% inhibition). ⁵ Catalase (mU/mL). 6 Malondialdehyde (nmol/mg). The experimental diets were added with fermented blood meal powder and liquid at each level, respectively (Con, P2, P4, P6, L2, L4 and L6). Values are mean of triplicate (n=3) and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

고찰

양식사료 내 혈분의 단순 첨가나 어분을 적정량 대체했을 경우에는 O. niloticus (Ambreen et al., 2023), S. aurata (Gisbert et al., 2015)의 성장에 부정적인 영향이 없었다고 보고되었다. 이에 더해, Hamed et al. (2017)은 T. blochii 사료 내 어분을 FBM으로 대체(15–45%)할 경우, 성장과 사료계수, 단백질전환효율이 증진되었으며, 동일한 비율로 어분을 대체할 경우, 일반 혈분에 비해 FBM이 좋은 효과를 보였다고 보고하였다. 그러나, Twahirwa et al. (2021)은 사료에 어분을 혈분으로 대체하는 농도가 증가(60–80%)될수록 사료 내 arginine, methionine, isoleucine의 함량이 감소되고 이와 같은 필수아미노산의 결핍으로 인해 단백질 합성이 저해되어 black carp Mylopharyngodon piceus의 성장이 저하되는 것으로 보고하였다. 이와 유사하게, FBM은 어류의 성장에 필수적인 methionine, isoleucine 함량이 적어 tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus 사료 내 어분을 FBM으로 9% 이하로 대체할 것으로 제시되었다(Usman et al., 2007). 아미노산 결핍은 신진대사에 문제를 야기하여 성장 저하, 단백질 소화 불량, 간 조직의 이상 변화와 같은 여러 문제점의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Marcouli et al., 2004). O. niloticus 사료 내 어분을 혈분으로 완전히 대체할 경우, 필수 아미노산의 결핍, 소화율과 사료 섭취 감소와 같은 부작용이 나타난다고 보고되었다(Kirimi et al., 2017). 본 연구에서도 FBM을 첨가함에 따라 사료 내 arginine, methionine, isoleucine의 함량이 감소하였으나, 뱀장어의 필수요구량(arginine, 1.7%; methionine, 1.2%; isoleucine, 1.5%)은 충족되는 것으로 나타났다(Hamidoghli et al., 2019). 따라서, 사료에 FBM을 소량(2–6%) 첨가하는 것은 뱀장어의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는것으로 판단된다.

MPO는 체내에서 병원성 미생물을 제거하는 hypochlorous acid (HOCl)와 tyrosyl radical을 생산한다(Hampton et al., 1998). Lysozyme은 선천성 면역체계에 있어 매우 중요한 항균 효소로 백혈구에 의해 생성되며, 항체생산과 식세포작용을 촉진한다(Saurabh and Sahoo, 2008). Ig는 병원균의 침입을 억제하는데 매우 중요한 역할을 하며, 어류의 점액에 풍부한 것으로 알려져 있다(Uribe et al., 2011). Gisbert et al. (2015)과 Twahirwa et al. (2021)은 S. aurata와 M. piceus 사료 내 혈분의 첨가가 lysozyme 활성을 증진시켰다고 보고하였다. FBM의 섭취가 어류의 면역에 미치는 영향에 관한 연구는 전무하다. 가수분해된 혈액의 헤모글로빈은 항균 펩타이드로써 기능하는 것으로 보고되었으며, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans에 대해 항균 활성이 있는 것으로 보고되었다(Hu et al., 2011). 현재의 연구에서 사료 내 FBM 첨가가 뱀장어의 선천성 면역력에 영향을 미치는 직접적인 메커니즘을 밝혀내지 못하였다. 그러나 증가된 선천성 면역력은 사료 내 FBM 첨가에 따른 뱀장어의 장 내 goblet cell에 의해 기인된 것일 수 있다. Goblet cell에 의해 생성되는 점액에는 lysozyme과 Ig, lectins, crinotoxins과 같이 병원균과 독소에 대항하는 항균 펩타이드가 풍부하여 면역력을 촉진시키는 것으로 보고되었다(Shephard, 1994). 따라서, 본 연구에서 FBM은 뱀장어 사료 내 면역 자극제로 작용하여 MPO, lysozyme, Ig와 같은 선천성 면역력을 증진시켜 항균 작용을 향상시키는 효과가 있다고 사료된다.

항산화 효소 활성은 생물의 산화 스트레스를 평가하기 위한 필수적인 지표이다(Ighodaro and Akinloye, 2018). SOD는 면역 반응의 부산물인 과산화수소를 산소로 분해하는 것을 촉매하는 항산화 효소이다(Ighodaro and Akinloye, 2018). CAT는 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 heme-함유 항산화 효소이며, CAT의 증가된 농도는 활성산소의 영향을 중화하기 위해 활성화된 항산화 상태를 의미한다(Khare et al., 2019). MDA는 활성 산소에 의해 생성된 산화과정의 최종 부산물이며, 세포와 조직에서 산화 스트레스의 수준을 나타내는 지표로 사용된다(Liu et al., 2011). Ogunji and Iheanacho (2021)은 C. gariepinus 사료 내 혈분 함량이 높아질수록(7–33%) SOD, glutathione peroxidase (GPx), CAT 활성이 감소하였으며, MDA 수준은 높아졌다고 보고하였다. Twahirwa et al. (2021)는 M. piceus 사료 내 어분을 혈분으로 20% 대체할 경우, 항산화력(GPx, CAT)을 증진시켰으나, 60% 이상 대체할 때는 오히려 항산화력을 감소시켰다고 보고하였다. 가수분해된 porcine 혈액의 헤모글로빈은 철 이온과의 높은 chelation 능력과 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 능력으로 인해 항산화 성분으로 사용될 수 있을 것으로 보고되었다(Chang et al., 2007). 본 연구에서 사료 내 FBM의 첨가는 CAT 활성에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, SOD 활성을 촉진하고 MDA 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 사료 첨가제로써 소량(2–6%)의 FBM은 뱀장어의 산화 스트레스를 줄일 수 있으며, 선천성 면역력을 높일 수 있는 면역증강제로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

혈액학적 지표에서 hemoglobin과 hematocrit은 기초건강도를 측정하기 위해 분석된다(Casanovas et al., 2021). AST와 ALT는 어류에서 간 건강 상태의 지표로 사용되며, 필수 영양소의 결핍과 여러 스트레스 요인에 의해 혈액 내 수치가 높아지는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2014). 본 연구 결과에서, 뱀장어 사료 내 FBM의 첨가는 hemoglobin, hematocrit, AST에 부정적인 영향을 주지 않은 것으로 나타났다. 하지만, ALT의 농도를 낮출 수 있는 것으로 확인되었다. 어류 혈장에서, ALT는 항산화 효소 활성에 의한 항산화력 증가 또는 용혈의 감소로 인해 감소될 수 있다고 보고하였다(Mirghaed et al., 2017). 따라서, 사료에 FBM의 첨가를 통한 증가된 항산화 효소는 뱀장어의 간세포 손상을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

소화효소의 활성은 사료의 소화율과 영양소 흡수율에 영향을 미치기 때문에 어류의 성장과 사료효율에 있어 매우 중요한 역할을 한다(Tian et al., 2019). 소화효소의 활성은 사용되는 원료 종류와 영양소의 함량에 영향을 받는다고 알려져 있다(Castro et al., 2013). Ogunji et al. (2020)은 C. gariepinus 사료 내 혈분의 첨가는 protease, amylase, lipase 활성을 향상시켜 영양소 소화율을 높이는 효과가 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 뱀장어 사료 내 FBM의 첨가는 뱀장어의 소화효소 활성을 증진시켜, 단백질과 탄수화물, 지질의 소화와 흡수를 높일 수 있을 것으로 사료된다. 그러나, 혈분이 소화효소 활성에 관여하는 작용 기전은 어종에 따라 다를 수 있다. Twahirwa et al. (2021)은 M. piceus 사료에 혈분을 첨가하면 오히려 amylase와 trypsin의 활성을 감소시킬 수 있다고 보고하였다. 따라서, 사료 내 FBM의 함량에 따른 뱀장어의 소화효소 활성에 대한 후속연구가 요구된다.

장은 체내 영양소 흡수에 중요한 역할을 하기 때문에, 장 조직의 병리학적 분석 결과는 어류의 영양 상태를 평가하는 지표로 활용된다(Rašković et al., 2011). Villus length는 영양소 흡수에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Gupta et al., 2020). Goblet cell은 장 점액을 분비하여, 물리적, 화학적 손상으로 부터 점막 상피를 보호하는 것으로 알려져 있다(Gomez et al., 2013). Kaplan et al. (2007)은 산화 스트레스가 장관벽을 손상시키고 장 투과성을 증가시켜 장 내 염증, 질병 감염 및 조직 발달과 같은 문제를 일으키는 주요 요인이라고 보고하였다. Gao et al. (2011)은 분무 건조 혈분을 돼지 사료에 10% 첨가하여 공급하였을 경우, 장 융모 길이와 넓이가 증가되었으며 이러한 이유로 항산화력 향상과 염증성 사이토카인 억제에 의한 것이라고 보고하였다. 이와 유사하게, 본 연구에서도 사료 내 FBM 첨가는 뱀장어의 항산화력을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이에 산화 스트레스가 억제되어 장 건강과 발달에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다. Gisbert et al. (2015)는 S. aurata 사료 내 혈분을 3–6% 첨가할 경우 goblet cell의 수를 증가시킨다고 보고하였다. 본 연구에서 뱀장어 사료 내 FBM의 첨가는 장내 융모의 길이를 증진시켰으며, goblet cell의 밀도를 증진시킨 것으로 나타났다. 따라서 사료 내 FBM의 첨가는 뱀장어 장 융모의 표면적을 넓혀 영양소 흡수를 증진시키고 점막을 보호하여 장 기능을 향상시키는 것으로 판단된다.

결론적으로, FBM의 형태와 상관없이 2–6%의 첨가 수준은 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 성장 결과를 바탕으로 FBM은 분말 형태가 액상 형태보다 효과적인 사료 첨가제로써 기능할 것으로 나타났다. 뱀장어 사료 내 적정량의 FBM의 첨가는 면역력, 항산화력과 소화효소 활성을 향상시키는 것으로 나타났으며, 장 기능을 증진시키는 것으로 나타났다. 따라서, FBM은 사료 기능성 첨가제로써 뱀장어의 성장 촉진과 면역 증진에 효과적일 것으로 사료된다.