Neuroprotective Activity of Cynaroside Isolated from Lysimachia christinae

금전초에서 분리한 cynaroside의 신경세포보호 활성

Abstract

In the previous study, we reported that cynaroside isolated from Lysimachia christinae methanolic extract had potent neuroprotective activities in neuronal cell death injured by excessive glutamate. In this study, we tried to confirm the neuroprotective activities of cynaroside in glutamate injured HT22 cells and establish mechanisms of neuroprotective action of cynaroside. We employed HT22 cells damaged by glutamate-induced cell death as a bioassay system. Cynaroside decreased reactive oxygen species increased by excessive glutamate treatment in HT22 cells. Also, Ca²⁺ concentration was decreased by cynaroside treatment. Cynaroside restored mitochondrial membrane potential to normal condition. It also increased not only glutathione reductase but also peroxidase to the control level. And it increased amount of glutathione, an endogenous antioxidant. These results suggested that cynaroside isolated from L. christinae showed potent neuroprotective activity through the anti-oxidative pathway.

현대 생명공학 기술의 발달로 인간의 기대 수명은 날로 늘어나고 있고 전체 인구 중 노인이 차지하는 비율 또한 매우 증가하였다. 이에 따라 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경계 질환도 마찬가지로 해마다 환자의 수가 증가하고 있다.¹⁾ 특히, 알츠하이머와 같은 치매는 우리나라와 같이 급속도로 진행되고 있는 노령화 사회에서 크나큰 사회적인 문제로 인식되고 있으며 전체 노인 중 약 10% 정도가 치매 환자일 정도로 심각한 사회문제로 대두되고 있다.²⁾ 더욱이 알츠하이머와 같은 치매는 다양한 사회적인 문제를 야기하는 사회적인 질병이지만, 이에 대한 확실한 병리학적인 원인과 치료제의 개발은 아직 요원하다. 치료제로 알려진 것들은 대부분 경미한 조건의 치료의 치료제로 개발되어 있고 근본적인 치료가 아닌 증상의 완화나 경감에만 효과가 있는 실정이다.^3,4) 이러한 이유로 알츠하이머의 치료제 개발은 과학적으로도 사회적으로도 매우 중요한 의미를 지닌다고 할 수 있겠다. 글루타메이트(glutamate)는 뇌에서 가장 풍부하게 존재하는 아미노산으로 신경세포에서 흥분성 효과를 나타내어 신경전달과 분화에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.⁵⁾ 그러나 글루타메이트 수용체의 과도한 활성화는 뇌의 세포 외액으로부터 끊임없이 글루타메이트를 제거하여 흥분성 신경독성을 나타내 신경세포의 사멸을 야기한다고 알려져 있다.⁶⁾ HT22 세포는 마우스의 해마에서 유래한 신경세포로서 HT22 세포에 고농도의 글루타메이트를 처리하게 되면 reactive oxygen species의 생성이 증가하고, 세포내 칼·이온의 농도가 증가하는 것으로 알려져 있는데, 이는 글루타메이트의 과발현에 의한 신경세포의 사멸과도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 생체 내에서 내재적으로 생산되는 항산화 물질인 글루타치온 (glutathione)의 생성 및 대사와 관련된 효소인 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 및 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase)의 활성을 낮추어 결과적으로 글루타치온(glutathione)의 생성량을 감소시키게 되어 일련의 증상의 결과로서 뇌신경세포가 사멸에 이르게 한다고 알려져 있다.^7-9) 치매의 원인은 확실하게 병인이 분자생물학적으로 밝혀진 바는 많지 않지만 원인에 따라 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 퇴행 및 파킨슨병 등과 같이 다양한 증상을 타나낼 수 있다. 이 중 가장 광범위하게 나타나는 흔한 증상으로는 알츠하이머병과 혈관성 치매가 있다. 알츠하이머병은 발병 기전이나 원인은 아직 정확하게 알려져 있지 않지만, 알츠하이머 환자의 뇌를 MRI나 CT 스캔으로 관찰한 결과 공통적인 부분이 몇 가지 나타나고 있다.¹⁰⁾ 알츠하이머병의 병변을 나타내는 뇌에 베타 아밀로이드 단백질의 생성이 과도하게 이루어져서 이들 단백질이 덩어리를 이루면서 침착됨으로써 뇌신경 세포가 정상적인 기능을 하지 못하고, 죽게 되는 것으로 알려져 있고, 뇌신경세포 내에 존재하는 타우 단백질은 과도하게 인산화되어 뇌세포의 골격을 유지하지 못하고 세포가 부정형을 이루게 되고 결과적으로 정상적인 기능을 하지 못하는 신경세포를 형성하여 뇌기능을 저하시킨다는 보고도 있다. 또한, 산화적 스트레스 및 염증반응 등도 뇌신경 세포를 사멸하게 하여 알츠하이머병의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.^11-14) 이러한 다양한 원인으로 신경세포가 사멸하게 되면 뇌와 같은 신경계 기관의 손상으로 이어져 결과적으로 인간에게 알츠하이머, 파킨슨병 등과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 야기하게 된다. 그러므로, 뇌신경세포를 보호하는 물질은 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제 개발의 주요한 타겟이 될 수 있다.

이에 본 연구진은 과량의 glutamate 투여로 인한 신경독성 및 산화적 스트레스에 의한 신경세포의 사멸을 막아주어 신경세포 보호 활성을 나타내는 천연물을 찾기 위하여 수 종의 천연물 추출물을 glutamate로 신경 독성을 유발한 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포를 검색계로 하여 신경세포 보호활성을 검색하였다. 실험 결과, 금전초(Lysimachia christinae)의 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 강력한 신경세포 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었고,¹⁵⁾ 금전초 총 메탄올 추출물로부터 신경세포 보호 활성을 나타내는 활성물질을 활성지향적 분리기법을 적용하여 분리하고 활성을 평가하여 수 종의 신경세포 보호 활성 화합물을 발견하였다.

본 연구에서는 glutamate를 독성물질로 처리한 HT22 세포를 활성검색계로 하여 이에 대한 신경세포 보호 활성이 보고된 금전초 추출물로부터 분리 정제한 cynaroside의 신경세포 보호 활성을 다시 한번 확인하고 신경세포 보호 활성의 작용기전을 밝히고자 하였다. 이에 glutamate로 신경 독성을유도한 HT22 세포를활성 검색계로하여신경세포의 사멸과 관련된 바이오 마커의 변화를 평가하여 cynaroside의 약리 작용 기전을 규명하는 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

시약및 재료 −Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, Glutamic acid, MTT solution, Trolox, NADPH, DTNB, GSSG-R(Glutathione disulfide reductase), GSSG oxidase, GSH(L-glutathione reduced), 2,7-dichlorofluorecin diacetate (DCF-DA), Fura-2AM, Rhodamin 123, Triton X-100, penicillin과 streptomycin은 Sigma Chemicals(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 대정화금^㈜에서 구입하여 사용하였다. Cynaroside은 기존에 분리하고 구조 동정한 화합물을 사용하였다(Fig. 1).¹⁶⁾

Fig. 1. Structure of cynaroside isolated from L. christinae.

HT22 세포 배양 − 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포의 세포 배양은 기존에 발표했던 원의 방법을 수정하여 수행하였다.¹⁷⁾ 요약하면, HT22 세포는 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂로 조절된 CO₂ incubator에서 배양하였다. DMEM 배지에는 10%의 FBS과 1%의 penicillin/streptomycin을 포함되었다. 활성평가를 위하여 시료나 독성물질을 처리하기 전까지 세포가 최적의 조건으로 배양될 수 있도록 2-3일 마다 한 번씩 subculture 해 주었다.

뇌신경세포 보호 활성 측정 − 뇌신경세포 보호 활성은 기존의 방법을 수정하여 진행하였다.¹⁸⁾ 세포 생존율은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 배양된 HT22 세포를 48 well plate에 2.0×10⁴/well의 농도로 seeding 하고 37 ℃, 5%의 CO₂의 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간후 control과 glutamate 처리군에는 배지 30 mL를 처리하고, 시료 투여군에는 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도의 cynaroside을 처리하였으며, positive control 처리군에는 50 μM Trolox를 투여하였다. 투여한 지 한 시간 후 control 그룹을 제외한 모든 well에 4 mM의 glutamate 30 mL를 투여하였다. 처리 후 24 시간 incubation 하고, 모든 well에 150 μL의 MTT solution(1 mg/mL in PBS)을 가하였다. 상온에서 3시간이 지난 후 각 well에 남아 있는 DMEM 배지를 suction하여 모두 제거하고 DMSO 300 μL를 처리하고 빛을 차단한 상태에서 30 분간 두어 formazan crystal을 충분히 녹여주었다. 다 녹인 solution을 96 well plate에 200 μL씩 분주하고 ELISA reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 같은 조건에서 3회 반복하였고, 얻어진 결과값을 통계처리 하였다.

세포 내 ROS 측정 – HT22 세포의 상대적인 free radical의 양은 2,7-dichlorofluroescin diacetate(DCF-DA)를 사용하는 Goodman과 Mattson의 방법으로 측정하였다.¹⁸⁾ HT22 세포에 trolox(50 mM) 및 cynaroside(1 mM,10 mM, 100 mM)를 처리하고 1시간 후 4 mM의 glutamate를 처리하였다. 8시간 배양 후 100 μM의 DCF-DA를 40 μL 첨가하고 1시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 1.0%의 triton X-100으로 세포를 37 ℃에서 15 분간 녹여낸 후 형광도를 측정하였다. 형광도는 490 nm에서 exciting 시킨 후 525 nm에서 emission light를 측정하였다. 실험은 같은 조건에서 3회 반복하였고, 얻어진 결과값을 통계처리 하였다.

세포 내 Ca²⁺ 농도 측정 − 배양된 HT22 세포에 trolox와 cynaroside을 처리하고 1시간 후 4 mM의 glutamate를 처리하였다. 배양한 HT22 세포에 20 μM의 Fura-2AM 10 μL를 투여한 후 1 시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척하고 난 뒤 1.0%의 Triton X-100 150 μL로 37 ℃에서 15 분간 녹여내었다. 형광도는 340 nm에서 exciting 시킨 후 510 nm에서 emission light를 측정하였다. 실험 결과는 세 번 반복하여 측정한 값을 통계처리 하였다.

미토콘드리아 막전위 손상 억제 효과 측정 −HT22 세포에 trolox(50 mM) 및 cynaroside(1 mM,10 mM, 100 mM)를 처리하고 1시간 후 4 mM의 glutamate를 처리하여 신경독성을유발하였다. 10 μL의 rhodamine 123을첨가하고 37 ℃에서 30 분간 반응시키고 PBS로 3회 세척한 후 1.0%의 Triton X-100 150 μL로 37 ℃에서 15 분간 녹여내었다. 형광도는 488 nm에서 exciting 시킨 후 525 nm에서 emission light를 측정하였다. 실험 결과는 세 번 반복하여 측정한 값을 통계처리 하였다.

글루타치온 총 함량 및 항산화 효소 활성 측정 − HT22 세포에 trolox(50 mM) 및 cynaroside(1 mM,10 mM, 100 mM)를 처리하고 1시간 후 4 mM의 glutamate를 처리하여 신경독성을 유발하였다. 24 시간 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 10,000 g, 4 ℃ 조건으로 30 분간 원심분리를 하여 170 mL의 상층액을 수집하여 항산화 효소와 글루타치온의 양을 측정하였다. 글루타치온 총 함량을 측정하기 위해서 세포 상층액 또는 글루타치온 표준품을 5 unit/mL glutathione reductase 및 0.3 mM NADPH가 담긴 반응액에 첨가하였다. 0.5 mM DTNB를 첨가하여 37 ℃에서 30초 동안 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 글루타치온의 양은 표준품 글루타치온의 표준치를 기준으로 하여 결정하였다. Glutathione peroxidase와 glutathione reductase의 활성을 측정하기 위하여 각각을 반응시킨 후 340 nm에서 각각 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 세 번 반복 실험 이후 측정한 값을 통계처리 하였다.

결과 및 고찰

MTT assay를 통한 뇌신경세포 보호 활성 측정 −건조된 금전초의 전초 부위 6 kg을 80% 메탄올로 추출하여 총 메탄올 추출물 641 g을 얻었다. 이를 용매의 극성에 따라 순차적으로 분획하여 n-hexane, CHCl3, ethyl acetate, n-butanol 분획물을 얻을 수 있었다. 금전초 총 메탄올 추출물과 각 분획물의 신경세포 보호 활성을 평가하여 글루타메이트로 신경 독성을 유발시킨 HT22 세포에서 신경세포 보호 활성을 평가한 결과 총 메탄올 추출물과 ethyl acetate 분획물, n-butanol 분획물에서 글루타메이트 신경독성에 의한 세포 사멸을 유의성 있게 차단하여 세포의 생존율을 증가시킨다는 결과를 얻었다. Ethyl acetate 분획물과 n-butanol 분획물로부터 다양한 분리 기법을 통하여 활성 물질을 분리하였고 그 구조를 동정하였다. 이들의 신경세포 보호활성을 평가하여 금전초 총 메탄올 추출물의 n-butanol분획으로부터 분리한 cynaroside(Fig. 1)이 신경세포 보호 활성을 보임을 보고하였다.¹⁵⁾ 이러한 cynaroside의 신경세포 보호 활성 작용기전을 밝히기 위하여 고농도의 glutamate로 흥분성 신경독성을 유발시킨 마우스 유래 해마 세포주인 HT22 세포를 활성검색계로 하여 신경세포 보호활성 평가 실험을 수행하였다. Cynaroside의 신경세포 보호 활성을 확인하기 위하여 4mM의 glutamate를 처리하여 HT22 세포에 신경독성을 유도한 후 MTT assay를 통하여 cynaroside의 신경세포 보호활성을 평가하였다. Cynaroside의 농도를 1.0 mM, 10.0 mM, 100.0 mM로 하여 전처리 한 후 1 시간 뒤에 4 mM의 glutamate를 처리하였고 24 시간 뒤에 세포의 생존율을 평가하였다. 실험 결과를 통하여 cynarside가 농도의존적으로 유의성 있는 신경세포 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2). Glutamate는 뇌에 매우 풍부하게 존재하는 아미노산으로 중추신경계에서 신경 전달 및 분화를 담당하는 매우 중요한 물질이지만, 과도하게 발현되거나 활성화되면 신경독성을 야기하게 된다.¹⁹⁾ 또한, 뇌신경세포의 손상과 같은 병리학적으로 활성화된 부위에서도 글루타메이트의 농도는 매우 높게 나타나며 이처럼 과도한 양의 glutamate는 흥분성 신경독성을 유발하거나 산화적인 스트레스를 나타내어 신경세포를 죽인다는 보고가 있다.⁶⁾ Cynaroside가 어떠한 작용기전을 통하여 glutamate의 신경독성에 의한 HT22 세포의 사멸을 막아주는지 확인하기 위하여 항산화와 관련한 다양한 바이오 마커의 변화를 평가하는 실험을 진행하였다. 항산화와 관련한 바이오 마커로서 세포 내 ROS, Ca²⁺ 농도, 미토콘드리아 막전위의 손상 억제 및 glutathione 총 함량과 glutathione reductase 및 glutathione peroxidase와 같은 항산화 효소 등을 평가하였다.

Fig. 2. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on glutamate-induced death of HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Cynaroside이 ROS의 생성에 미치는 영향 − 글루타메이트는 신경전달물질로서 신경의 기능을 담당한다. 세포내 과도한 글루타메이트의 축적은 세포내 활성산소종(ROS)의 농도 증가를 야기하여 신경독성이 발생한다. 활성산소종의 농도 증가는 신경세포의 사멸과 매우 밀접한 관련이 있으며 이를 통하여 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 급성 뇌손상 질환을 야기할 수 있고 만성 퇴행성 신경질환의 발생도 이와 연관되어 있다.²⁰⁾ Cynaroside가 glutamate에 의하여 손상을 입은 신경세포의 사멸에 대한 보호 작용을 나타내는 것이 ROS의 생성량과 관계가 있는지 확인하기 위하여 형광 시약 DCF-DA를 사용하였다. Cynaroside의 투여가 과량의 glutamate에 의하여 145.8%로 증가한 ROS의 생성량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시킴을 확인할 수 있었다. 1.0 mM의 cynaroside 투여군에서는 control 대비 134.5%의 감소를 보였으며 cynaroside의 투여 농도가 증가할수록 ROS의 생성 감소량 또한 증가하여 100.0 mM의 cynaroside을 투여한 실험군에서는 거의 정상상태 수준으로 control 대비 약 114.9% 수준으로 ROS의 생성량을 감소시켜 주었다(Fig. 3). 이 결과를 통해 cynaroside은 농도 의존적으로 강력한 ROS 생성 억제능을 가지며 ROS로 인한 세포 사멸을 막아준다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on reactive oxygen species production in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Cynaroside가 세포 내 Ca²⁺ 농도에 미치는 영향 − 흥분성 아미노산인 glutamate에의한 신경세포의 자극은 때때로 신경 세포의 분화 및 생존과 관련한 세포질 내의 칼슘이온 농도의 증가를 나타내기도 한다.²¹⁾ 또 다른 연구에 따르면, carbonyl cyanide p-trifluo-romethoxyphenyl-hydrazone 화합물에 의하여 reactive oxygen species의 생성을 줄이면 세포내로 증가하는 Ca²⁺의 농도를 낮출 수 있다는 보고도 있으며, 또한, 코발트에 의하여 Ca²⁺의 세포 내로의 유입을 차단할 경우, 과량의 glutamate를 처리하여도 활성 산소종의 생성은 크게 증가하지 않는다는 보고도 있다.^22,23) 이러한 연구 결과들은 활성 산소종의 생성 및 축적이 세포 내 Ca²⁺의 농도와 서로 밀접하게 작용하고 있음을 시사할 수 있겠다.²⁴⁾

Cynaroside가 glutamate로 세포 사멸을 유도한 HT22 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 이온의 농도에 미치는 영향을 평가하기 위하여 형광 염료인 Fura-2AM을 사용하였다. Cynaroside의 투여가 과량의 glutamate에 의하여 144.6% 수준으로 증가한 Ca²⁺의 세포 내 농도를 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시킴을 확인할 수 있었다. 1.0 mM의 cynaroside 투여군에서는 125.9%로 감소를 나타내었으며 cynaroside의 투여농도가 증가할수록 Ca²⁺의 농도 또한 감소하여 100.0 mM의 cynaroside을 투여한 실험군에서는 거의 양성 대조군인 Trolox 투여군과 비슷한 수준으로 Ca²⁺의 농도를 감소시켜주었다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on calcium ion influx in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Cynaroside가 미토콘드리아의 막전위 손상에 미치는 효과 − 신경세포에서나 일반경세포에서도 미토콘드리아는 세포의 사멸에 매우 필수적인 중요한 역할을 한다. 글루타메이트의 신경독성은 세포 내 칼슘이온의 항상성을 유지하는 데에 실패하여 미토콘드리아의 막 전위의 붕괴를 유발하는 것으로 알려져있다.²⁵⁾ 이로 인하여 나타나는 미토콘드리아 막에서의 탈분극은세포의 apoptosis를 유발하는 데에 매우 중요한 단계이며 이에 따라 세포 내 활성 산소종의 증가를 야기하게 된다.²⁶⁾ 따라서 형광염료 rhodamine 123을 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 측정하여 glutamate에 의한 미토콘드리아 손상에대한 cynaroside의 보호 효과를 평가하였다. 실험 결과, cynaroside을 투여한 그룹에서 glutamate에 의하여 감소한 막전위를 농도의존적으로 회복시켜주었고 100.0 mM의 cynaroside을 투여하였을 때 미토콘드리아의 막전위는 대조군을 100%로 하였을 때 84.5%에 해당하는 값으로 양성대조군인 trolox를 투여한 그룹과비슷한 활성(96.5%)을 나타냈다(Fig. 5).

Fig. 5. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on glutamate-induced disruption of mitochondrial membrane potential in HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Cynaroside가 글루타치온 함량과 항산화 효소 활성에 미치는 영향 − 글루타치온은 주요 항산화제이자 산화환원 조절자로서 다양한 효소의 보조인자로 작동한다. 시냅스에 존재하는 glutamate는 주요 흥분성 신경인자로 글루타치온의 생성의 실패나 감소는 퇴행성 뇌신경계 질환과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 보인다.²⁸⁾ 따라서, cynaroside가 글루타치온 및 그의 생합성과 관련한 효소인 글루타치온 리덕타제 및 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성에 미치는 영향을 평가하였다. Cynaroside의 투여가 과량의 glutamate 투여에 의한 신경독성으로 인하여 38.7%로 감소한 글루타치온의 총 생성량을 농도 의존적으로 유의성 있게 증가시킴을 확인 할 수 있었다. 1.0 mM의 cymaroside 투여군에서는 control 대비 43.9%로의 증가를 보였으며 cynaroside의 투여 농도가 증가할수록 글루타치온 총 생성량이 증가하여 100.0 mM의 cynaroside을 투여한 실험군에서는 glutamate만 투여한 군에 비하여 글루타치온의 함량이 control 대비 57.1%로 그 생성이 증가함을 보였다(Fig. 6). 또한, cynaroside은 100.0 mM의 농도에서 glutamate만 투여한 군에 비하여 글루타치온 리덕타제의 활성을 55.9% 수준까지증가시켰다(Fig. 7). Cynaroside은 글루타치온 퍼옥시다제의 활성 또한 증가시켰는데 100mM의 농도에서 glutamate만 투여한 군에 비하여 85.4% 증가시켰고, 양성대조군인 Trolox 투여군은 glutamate만을 투여한 군에 비하여 79.1% 증가시켜 양성 대조군 보다 높은 수치를 나타내었다(Fig. 8).

Fig. 6. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on glutathione level in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Fig. 7. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on glutathione reductase in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Fig. 8. Effect of cynaroside (1.0, 10.0 and 100.0 mM) on glutathione peroxidase in glutamate injured HT22 cells. Data expressed as mean ± the standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus the glutamate-treated group.

Cynaroside는 luteolin-7-O-glucoside, luteoloside, glucoluteolin등 여러 가지 이름으로 알려져 있으며, 여러 약용식물에서 발견되는 흔한 비교적 구조가 단순한 flavonoid 골격을 이루고 있는 성분으로 신선초(Angelica keiskei)와 인동덩굴 (Lonicera japonica Thunb.)에서 분리되어 효능이 알려져 있다.²⁷⁾ 현재 이 화합물에 대하여 항산화활성, 지질단백질 산화 억제와 같은 연구가 진행되어 있다. 하지만 cynaroside 같은 물질이 현재 흔히 사용되고 있는 항암제들에 의한 부작용(신장독성과 심근독성)을 억제할 수 있는지에 대한 연구가 수행되지 않았다.²⁷⁾ Cynaroside은 지금까지 다양한 연구를 통하여 강력한 인플루엔자 RNA-dependent RNA 중합효소 억제제로 알려져 있으며, H₂O₂로 유도된 apoptosis의 억제제로도 연구가 진행되어 있다. Cynaroside는 또한 항세균, 항진균, 항암, 항산화, 항염증 활성 등과 같은 생리활성이 보고되어 있다.^28,29) 뇌신경계와 관련된 연구내용으로는 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA 신경세포의 손상을 유도하였을 때 이를 보호해 주는 영향을 나타내었다는 보고가 있지만 이러한 결과는 본 논문의 결과와 검색계를 달리한 결과이다.³⁰⁾ Cynaroside은 구조가 비교적 복잡하지 않은 flavonoid의 구조를 가지고 있으며 작용기전을 연구한 결과 glutamate에 의한 신경세포의 사멸을 야기하는 산화적 스트레스에 대항하여 항산화 활성을 보임으로써 신경세포 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었고, 향후 수미로 테스트나 수동회피 시험과 같은 동물 행동실험을 추가로 진행하여 좋은 결과를 얻는다면 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 뇌신경계 질환의 치료제 및 예방약으로 개발할 수 있는 가능성이 있을 것으로 생각된다.

결론

본 실험 결과를 종합하여 보면, 금전초 추출물로부터 분리한 cynaroside이 glutamate의 흥분성 신경독성에 의한 신경세포의 사멸을 보호한다는 점을 확인할 수 있었다. Cynaroside은 세포 내 활성 산소종의 생성을 감소시키고, Ca²⁺ 농도를 낮추어 주었으며, 미토콘드리아의 막전위를 정상으로 회복시켜주어 glutamate로 인하여 발생하는 신경세포의 사멸을 막아주는 역할을 하였고, 생체 내에서 강력한 항산화제로 작용하는 글루타치온의 생성을 증가시켰으며 glutathione reductase, glutathione peroxidase와 같은 효소의 활성을 증가시켰다. 이러한 연구 결과를 통하여 플라보노이드 성분인 cynaroside의 신경세포 보호활성은 전반적으로 항산화 활성을 통하여 나타냄을 확인할 수 있었다. 종합적으로 cynaroside이 현대 큰 사회적 문제 중 하나인 하나인 알츠하이며 병의 치료 및 예방제의 후보 물질 로서의 가능성이 있음을 시사하며 향후 동물 행동실험을 통하여 기억력이나 인지능 개선활성을 평가하여 활성을 검증해 볼 만한 가치가 있을 것으로 생각된다.