방사선 조사 후 적혈구의 형태적 고찰

Morphological Review of Red Blood Cells After X-ray Irradiation

Abstract

본 연구는 전신 방사선 조사 후 적혈구의 형태적 변화를 고찰하고자 하였다. 혈액 시료는 방사선 조사한 랫드(Rat)와 마우스의 적혈구를 사용하였다. 투과전자현미경 관찰결과, 5 Gy 조사 후 20일 지난 적혈구에서 대소부동증이 관찰되었다. 작은 적혈구에서는 삼각형, 테트라포드형의 형태가 관찰되었다. 일반적 크기의 적혈구에는 변형적혈구, 낫 모양의 겸상적혈구, 유극적혈구 등이 관찰되었다. 7 Gy 조사 후 20일 지난 적혈구는 분열적혈구가 관찰되었다. 주사전자현미경 관찰결과, 작은 적혈구들과 함께 누적적혈구가 관찰되었다. 또한 적혈구들이 서로 엉킨 상태의 군집된 형태도 확인되었다. 그 외 다각형의 모양, 반달 모양의 변형된 형태도 관찰되었다. 결론적으로 방사선 피폭에 의한 적혈구 연구는 수적 변화보다 변형된 형태의 병적 연구가 더 중요한 것으로 판단된다.

This study attempted to concider the morphological change of red blood cells after whole body irradiation. Blood samples used red blood cells of white mice and mouse after irradiation. Transmission electron microscope observation results, Anisocytosis was observed in red blood cells 20 days after 5 Gy irradiation. Triangle and tetrapod were observed for small red blood cell types. Poikilocytosis, sickle-shaped Drepanocyte, and Acantocyte were observed in general-sized red blood cells. Schizocyte was observed in red blood cells 20 days after 7 Gy irradiation. Scanning electron microscope observation results, Dacryocyte was observed with microcytes. It was also confirmed that red blood cells were get tangled with each other. In addition, polygonal shapes and half-moon shapes were also observed. In conclusion, it is judged that the modified form of pathological study is more important than the numerical change in the study of red blood cells by radiation exposure. In conclusion, it was confirmed that modified morphological studies are more important than numerical changes in the study of red blood cells by radiation exposure.

Ⅰ. INTRODUCTION

조혈조직은 방사선감수성이 높은 조직이다^[1]. 그중 혈장과 혈구의 방사선에 관한 연구에서는 혈장보다는 혈구 세포에서 민감하게 작용하는 것으로 보고되었다^[1,2]. 혈액 구성은 혈구가 45% 차지하고 대부분이 적혈구이다^[3]. 이러한 혈구는 방사선의 선량 증감에 따라 수적, 형태학적 변화를 가져오는 것으로 알려졌다^[4,5]. 혈구의 수적 변화는 림프구와 백혈구에서 선량 증가에 따른 감소의 변화가 크고 혈소판이 다음으로 보고되었으며 적혈구는 수적 변화의 차이가 적은 것으로 알려졌다^[6-8].

최근 최 등이 연구한 민들레 추출물 투여 후 방사선 조사에 대한 보고에서도 백혈구, 혈소판의 수는 감소하였으나 적혈구의 수치 변화는 없었다^[9]. 혈구는 미분화된 줄기세포로부터 만들어지는데 적혈구계, 백혈구계, 혈소판계와 각종 유약형이 분화되어 성숙한 혈구가 되어 말초혈액으로 나오게 된다^[10]. 방사선 피폭에 의한 백혈구와 임파구의 손상은 세포막과 핵막, 소기관들이 유동적 생명 활동을 수행함에 따라 형태학적으로 손상된다고 보고되었다^[4]. 혈소판에서도 소기관들과 미세구조에 대한 손상이 보고되었다^[11].

이에 반해 적혈구는 핵막과 내부 소기관의 구조물이 없다. 외부는 도넛 모양으로 핵이 없으며 양쪽이 함몰되어 옆에서 보면 아령 모양을 하고 있다. 크기는 7 ~ 8 μm 로 혈구 중에서 중간 정도의 크기로 혈색소와 조혈인자에 의해 조절된다^[3,10]. DNA와 RNA가 없기 때문에 세포 복구나 성장 및 세포분열 등에 필요한 단백질 합성을 할 수 없다.

따라서 적혈구에서 방사선 피폭과 관련된 연구는 내·외부형태학적 관찰보다 수적 변화를 중심으로 연구되고 있다^[6-8,12]. 따라서 크기나 형태가 변형되면 역할과 기능에도 영향을 가져오지만 그에 대한 연구는 부족하다. 이러한 적혈구의 형태학적 연구는 광학현미경으로는 정확한 관찰이 어렵기 때문에 전자현미경을 활용한 연구가 활용된다.

지등이 보고한 X-선 조사 후 대동맥 혈구에서 방사선 피폭 시 적혈구의 형태학적 관찰이 있었으나 이는 방호효과를 중심으로 한 연구로 일부분에 국한되어 있어 적혈구에 대한 전체적인 연구는 미흡하다^[4,5].

본 연구는 선행 연구된 자료를 참고하여 적혈구에서 투과전자현미경과 주사전자현미경에서 얻은 영상을 분석하여 형태학적 손상을 고찰하고자 하였다. 그 일환으로 진단혈액학의 기준을 참고하여 분석하고자 하였다.

진단혈액학에서는 적혈구 형태학적 크기의 분류는 외부 크기에 따라 대소부동증, 거대적혈구, 소적혈구로 구분하고 있다. 형태변화의 분류와 특징에서는 변형적혈구, 유극적혈구, 포진상적혈구, 극피적혈구, 난형적혈구, Helmet cell, 농축적혈구, 분열적혈구, 겸상적혈구, 구상적혈구, 구순적혈구, 누적적혈구 등으로 정리하고 있다^[13,14].

따라서 본 연구의 영상분석은 투과전자현미경에서는 단면상의 형태적 변화를 분석하고, 주사전자 현미경에서는 외부 크기와 형태학적 모양을 제시된 기준으로 분석하고 고찰하였다.

적혈구의 분류는 다음과 같이 하였다.

1) 적혈구 크기 변화 분류

⦁정상 적혈구(Normocyte) : 직경이 6∼8 μm를 갖는 정상적인 크기의 혈구, discocyte라고도 함

⦁대소부동증(Anisocytosis) : 크기가 정상을 벗어난 크고(9 μm 이상), 작은(6 μm 이하) 것이 뒤섞여 나타남

⦁거대적혈구(Megalocyte) : 직경 12 μm 이상의 크기, Vit. B12 결핍, folic acid, 빈혈에서 나타남

⦁대적혈구(Macrocyte) : 직경 8 μm 넘는 세포, Vit B12 또는 엽산 결핍에 의한 것으로 대개 초생체 염색에서 망상 적혈구로 모양으로 보이는 유약 적혈구 임

⦁소적혈구(Microcyte) : 직경 6 μm 이하, 철 결핍에 의해 만들어짐

2) 적혈구 형태 변화 분류 및 특징

⦁변형적혈구증(Poikilocytosis) : 세포의 형태가 일정하지 않은 세포들로 형태가 여러 가지 보인다. 파괴되기 바로 전 단계의 적혈구로 보임

⦁유극적혈구(Acantocyte; Spur cell) : 구형 적혈구로 불가역성 가시(spur)가 생겨난 돌기가 있다. 외부 주변 모양이 불규칙적이며 가늘고 길게 나타남

⦁겸상적혈구(Drepanocyte; Sickle cell) : 혈색소 S를 포함하고 있는 세포, 주로 낫 모양으로 보이며 빈혈증에 나타남

⦁포진상적혈구(Blister cell) : 세포 주변부에 대단히 얇은 부분이 있는 적혈구를 말함. 한 개 또는 여러 개의 공포가 나타남

⦁극피적혈구(Echinocyte; burr cell; crenated cell, berry cell) : 세포막에 일정하게 짧고 둔한 돌기가 전표면에서 같은 크기로 보임. 위암, 위궤양, 요독증, pyrubate kinase 결핍, 화상 등에서 보임

⦁난형적혈구(Elliptocyte; ovalocyte) : 전체 적혈구의 약 1%, 악성 빈혈이나 선천성 질환 25% 이상에서 나타남

⦁Helmet cell : 혈관 내 폐색 때문에 이곳을 통과하는 적혈구가 팽팽하게 잡아당긴 것처럼 분절되어 크기가 작은 세포단편 이 된다. 이는 포진상 세포의 파열로 생기며, 구상 적혈구 및 helmet cell이 됨

⦁농축적혈구(Pyknocyte) : Burr cell과 유사한 돌기가 있다. G-6-PD 결핍증, 급성 중증 용혈성 빈혈, 용혈성빈혈, 유전성 lipoprotein 결핍증에서 나타남

⦁분열적혈구(Shistocyte; Schizocyte) : 적혈구가 기계적 장애를 받아 파괴되거나 분절된 경우 나타남. 심한 화상, 모세혈관 용혈성빈혈, 혈색소뇨증 등에서 보임

⦁구상적혈구(Spherocyte) : 아주 작은 적혈구로 혈색소가 농후하게 포함되어 있어 구형을 이룸. 부적합 임신부에 의한 신생아의 ABO식 용혈성 빈혈이나 수혈반응, 열상에 의해 발견됨

⦁구순적혈구(Stomatocyte) : 얕은 접시 모양의 작은 보조개를 갖는 구형의 모양이 있음. 알콜중독성 간경변증에서 single concavity를 갖는 bowl 모양의 적혈구로 나타남

⦁누적적혈구(Dacryocyte) : 눈물 방울 세포(tear drop cell)라고 함. 척수로 성 빈혈, DIC에서 골수 섬유증, thalassemia에서 발견됨

Ⅱ. MATERIAL AND METHODS

1. 선형가속기 X-선 조사

랫드(Rat)와 마우스는 6-8 주령을 사용하였다. 실험 동물은 각각 분리하여 30 cm × 30 cm 크기의 상자에 넣었다. 윗부분은 아크릴로 눌어 높이를 같게 하였다. 실험동물은 영남대학교 의과대학 동물 실험실에서 최적화된 환경에 사육하였다. 방사선 조사는 Linac(Clinac 21 EX-S, USA, 2006)을 이용하여 흡수선량은 6 Mev 에너지로 대향이문조사를 실시하였다. SSD는 100 cm으로 고정하고 심부선량 위치를 2 cm로 한 다음 전신 5 Gy (215 MU), 7 Gy (301 MU)로 나누어서 X-선을 조사 하였다.

2. 혈액 시료 준비

방사선 조사 후 10일, 20일 지난 후 전혈 5 cc를 시료로 채취하여 원심분리기를 이용하였다. 시료는 3000 rpm 혈장과 혈구로 분리한 후 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope; TEM), 주사전자 현미경 (Scanning Electrion Microscope; SEM)의 시료로 사용하였다.

3. 적혈구 투과전자현미경(TEM) 시료 제작

혈액 교반은 랫드(Rat)의 혈액 시료를 항응고제 (heparin)가 들어 있는 5 ml tube에서 진행하였다. 그 후 3000 rpm 으로 3분 동안 원심분리 하였다. 적혈구 층의 시료는 분리된 윗부분의 플라스마 층을 제거한 다음 사용하였다. 다음으로 glutaraldehyde (4%, Polyscience)에서 시료를 4 ℃ 1시간 이상 전고정 하였다. osmmium tetraoxide (1%, Polyscience)로 1시간 30분 동안 후고정 하였다. 그 후 계대 탈수과정을 하기 위해 ethyl alcohol (Merck)을 사용하였다.

치환은 propylene oxide (Merck)로 하였다. 포매는 epon resin (polyscience)에 60 ℃ 배양기에서 38시간이상 중합하여 block을 제작하였다^[15].

ultra microtome 을 이용하여 80 nm로 박절 과정을 거친 후 uranyl acetate (Polyscience)와 lead nitrate (Polyscience)로 이중 염색을 하였다. 투과전자현미경 관찰은 H-7000(Hitachi, Japan)으로 하였다.

4. 적혈구의 주사전자현미경(SEM) 시료 제작

주사전자현미경 관찰은 전혈 1cc를 2.5% glutaraldehyde에서 2시간 전고정 하였다. 그 후 0.1 M PBS로 3회 세척하였다. 다음 OSO₄에서 후고정 하였다. 탈수과정은 70% - 100% ethanol에 하였다. 그다음 t-butyl alcohol로 치환하였다. 이후 freeze dryer 를 사용하여 동결 건조한 다음 stove에 부착 후 혈구를 관찰하였다. 전체 단계는 centrifuge (Hanil, Micro-12, Korea)을 사용하였으며, 3,000 rpm으로 3분간 분획화 한 후 pellet 부분을 시료에 사용하였다^[16]. 적혈구 시료는 gold coating 한 다음 SEM (Hitachi, S-2500C, Japan) 으로 관찰하였다.

Ⅲ. RESULT

1. 적혈구의 투과전자현미경(TEM) 분석

1.1. 5 Gy 조사 후 적혈구 관찰

방사선 5 Gy 조사 후 랫드(Rat) 적혈구는 대조군과 비교하여 형태학적 차이가 많은 것으로 확인되었다. 적혈구의 수적 변화의 차이는 크지 않았다. 방사선을 조사하지 않은 적혈구는 Fig 1 - (A), (B)와 같이 대소부동증(anisocytosis)이 거의 관찰되지 않았으며 고른 형태와 일정한 크기로 관찰되었다. 단면상에 따른 일정 부분에서는 돌기가 있는 형태도 일부 확인되었다. 방사선 조사 후 20일이 지난 적혈구에서는 Fig 1. - (C)와 같이 크기 차이가 현저하게 관찰되는 대소부동증이 확인되었다. 정상 크기보다 큰 대적혈구(macrocyte)는 대부분 둥근 구형의 형태를 보이지 않았으며, 소적혈구에 비해 많이 관찰되었다. 반면 크기가 작은 소적혈구(microcyte)에서는 삼각형 형태나 테트라포드의 모양으로 변형된 적혈구가 많은 것으로 나타났다.

Fig. 1. Transmission Electron Microscophy of Rat Red Blood Cells. Normal (A, B), 20 days of After 5 Gy Irradiation (C, D). (Po: Poikilocyte, Ac: Acantocyte, Dr: Drepanocyte, Ma: Macrocyte, Me: Megalocyte, Mi: Microcyte)

형태학적 이상을 보이는 적혈구 중에는 변형적혈구(poikilosperocyte)가 많이 관찰되었다. 변형적혈구는 크기가 작고 형태가 일정하지 않으며 정상적인 구형의 모양이 아닌 테트라포드의 형태로 관찰되었다. 다음으로 많이 관찰되는 적혈구는 겸상적혈구(drepanocyte)로 확인되었다.

유극적혈구는 낫 모양으로 정상 적혈구 보다 크기가 크고 초생달 처럼 가늘고 긴 반원 모양을 하고 있는 것으로 관찰되었다. 또한 가장 자리가 뽀족하게 보이는 것도 확인되었다. 그 외 구형의 형태를 가지고 있으면서 가장자리 가시돌기가 형성된 유극적혈구(Acantocyte)도 확인되었다.

거대적혈구는 Fig. 1 - (D)와 같이 엽산이나 Vit B12 결핍에서 발견되는 12 μm 이상의 거대 적혈구도 관찰되었다. 형태는 완만한 돌기가 여러 개가 돌출된 형태로 관찰되었다.

1.2. 7 Gy 조사 후 적혈구 관찰

방사선 7 Gy 조사 후 20일 경과 된 Fig. 2의 적혈구의 관찰에서는 5 Gy 조사한 실험군 보다 변형적혈구가 많이 관찰되었다. Fig. 2 - (A)에서는 적혈구의 크기가 대부분 정상 적혈구 보다 작은 것으로 보였으며, 형태는 삼각형 모양, 긴 타원 모양, 우주선의 모양을 한 적혈구도 확인되었다. 선량 증가에 따라 특징적으로 나타나는 형태는 Fig. 2 - (B)와 같이 분열적혈구(schizocyte)가 관찰되었으며, 적혈구에는 돌기들이 대부분 형성된 것으로 관찰되었다.

Fig. 2. Transmission Electron Microscophy of Rat Red Blood Cells. 20 days of After 7 Gy Irradiation (A, B, C, D) (Po: Poikilocyte, Ac: Acantocyte, Dr: Drepanocyte, Ma: Macrocyte, Me: Megalocyte, Mi: Microcyte, Sc: schizocyte, Tetra: tetragon)

겸상적혈구는 낫 모양으로 가늘고 길게 둥근 모양으로 관찰되었다. 그 외 적혈구 가장자리 형태가 각진 사각형(tetragon)의 형태도 관찰되었다. 하지만 적혈구 내부에 공포나 기포를 보이는 혈구는 확인되지 않았다.

2. 적혈구의 주사전자현미경(SEM) 분석

2.1. 외부 형태 크기에 따른 관찰

방사선 5 Gy 조사 후 10일 경과 된 마우스 적혈구의 SEM을 활용한 외부 형태는 대소부동증의 크기 변화가 많이 관찰되었다. 그 중 Fig. 3 - (A), (B)와 같이 거대적혈구 보다는 철 결핍성에 의해 생성되는 소적혈구(microcyte)가 여러 개 확인되었다. 더불어 척수성 빈혈에서 발견되는 눈물방울 모양의 누적적혈구(dacryocyte)도 확인되었다.

Fig. 3. Scanning Electron Microscophy of Mouse Red Blood Cells. 10 days of After 5 Gy Irradiation(A, B, C, D). (Mi: Microcyte, Da: Dacryocyte, Pl: Platelet, Ta: tangle, Dr: Drepanocyte, Ec: Echinocyte)

2.2. 적혈구 표면 관찰

빈혈 또는 산소 접촉에 의해 많은 돌기가 형성되어 있는 혈소판(platelet)도 Fig. 3 - (D)와 같이 확인되었으며, 섬유소에 의해 적혈구 표면에 가는 실모양의 섬유질 그물이 형성된 모습도 확인하였다. 일부 Fig. 3 - (B)에서는 적혈구들이 엉킴(tangle)에 의해 군집된 덩어리 모양을 하고 압착에 의해 변형된 적혈구들도 관찰되었다.

2.3. 변형 적혈구 관찰

본 연구 결과, 겸상적혈구(Drepanocyte)가 많이 관찰되었다. 겸상적혈구는 Fig. 3 - (C)과 같이 도넛 모양이 아닌 끝이 뽀족하게 생긴 귀리 형태로 관찰되었다. 이는 빈혈 시 관찰되는 이상 적혈구로 방사선 조사 시에도 확인되었다.

극피적혈구(Echinocyte)는 대적혈구의 형태로 관찰되며 Fig. 3 - (D)과 같이 혈구 가장 자리에 둔한 모양의 돌기를 형성하는 것으로 관찰되었다. 또한 가운데 보조개 모양이 없는 둥근 공 모양의 적혈구들이 많이 확인되었다.

2.4. 5 Gy 조사 후 20일 경과 된 적혈구 관찰

5 Gy 조사 후 20일 경과 된 적혈구 관찰에서는 Fig. 4 - (A)와 같이 다각형(polygon) 모양을 하는 적혈구와 타원 적혈구들이 관찰되었다. 방사선 조사 후 시간이 경과 될수록 서로 엉켜(tangle)서 뭉친 형태를 하거나 깨진(broken) 모양을 하는 혈구들도 그림 Fig. 4 - (B)와 같이 관찰되었다. 그 외 Fig. 4 - (C)와 같이 가운데 보조개 없고 테두리 가장자리에 움푹 파인(cave-in) 혈구와 반달모양(half moon)의 적혈구도 관찰되었다. 군집 된 혈구에서는 서로 뭉쳐져 눌린 모양을 하거나 포개진 상태로 겹쳐진 모습을 하는 적혈구들도 Fig. 4 - (D)와 같이 관찰되었다. 더불어 적혈구 표면에는 섬유성 물질들이 많이 붙어 있어 원활한 혈관 이동에 영향을 미칠 것으로 관찰되었다.

Fig. 4. Scanning Electron Microscophy of Mouse Red Blood Cells. 20 days of After 5 Gy Irradiation(A, B, C, D). (Po: Polygon, Ta: Tangle, Bk: Broken, Ca: Cave-in, Hm: Half moon, Md: Modify)

Ⅳ. DISCUSSION

적혈구는 골수 줄기세포에서 형성되어 적혈모구와 망상적혈구를 거쳐 완성된 적혈구를 형성한다. 이러한 적혈구는 생체 내에서 산소와 이산화탄소를 운반하는 역할을 하므로 산소가 존재할 때 방사선에 대한 감수성은 높게 된다. 따라서 적혈구도 방사선의 영향을 받을 수밖에 없다.

반면에 백혈구나, 임파구, 혈소판 등은 세포막이 있고 내부에 소기관이 존재하므로 방사선 피폭에 의한 세포막과 소기관의 손상에 의해 세포는 사멸하게 된다. 따라서 혈구 수의 변화를 가져오게 되고 선량의 증가에 따라 수적 변화가 감소한다. 그중에 가장 영향을 많이 받는 부분은 인과 지질로 구성된 세포막과 핵막의 파괴에 의해 일어난다. 이에 비해 적혈구는 세포막도 소기관도 없다. 하지만 물 분자에 의한 전리 현상은 일어난다. 선행연구에서도 방사선 피폭에 의한 적혈구의 변화는 크게 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있다.

본 연구 결과, 적혈구의 수적 변화가 없다고 해서 정상적인 기능과 형태를 보인다고 할 수 없다는 것을 확인하였다. 투과전자현미경 관찰에서 대조군에 비해 5 Gy 조사된 연구에서 소적혈구들이 많이 관찰되었다. 이러한 소적혈구들은 철의 함유량이 부족할 때 확인된다. 이는 세포에 산소 공급을 원활하지 못하게 한다고 볼 수 있다. 따라서 방사선 피폭이 철 결핍성 빈혈에도 관련이 있다고 볼 수 있다.

또한 변형적혈구도 많이 관찰되었다. 이는 적혈구가 일정한 형태를 가지지 못하고 있는 것으로 파괴되기 직전에 나타나는 형태로 보여 진다. 적혈구의 수명이 120일 정도 되는 것으로 볼 때 방사선 조사 후 10일에서 30일까지는 적혈구의 수적 변화를 확인하는 것은 부족하다고 볼 수 있다.

Ⅴ. CONCLUSION

본 연구 결과, 투과전자현미경 관찰에서 유극적혈구, 겸상적혈구가 많이 관찰되었다. 유극적혈구는 가장자리에 돌기가 형성되었으며, 겸상적혈구는 낫 형태나 귀리 모양으로 관찰되었다. 주사전자현미경 관찰에서는 적혈구들이 서로 뭉치거나 겹친 모양을 보였으며 다각형의 형태를 가진 혈구들도 많이 관찰되었다. 이러한 적혈구들의 변형은 적혈구의 조기 파괴를 유도하고 철 겹핍에 의한 산소 운반에 영향을 준다고 볼 수 있다.

결론적으로 방사선 피폭시 적혈구의 형태적 이상은 발생하며 여러 형태의 변형된 적혈구가 많이 관찰되는 것으로 확인되었다. 따라서 방사선에 의한 적혈구의 변형 기작에 대한 연구가 계속적으로 필요할 것이다.