Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Effects of Dietary Prebiotics and Probiotics on Growth, Immune Response, Anti-oxidant Capacity and Some Intestinal Bacterial Groups of the Red Seabream Pagrus major

사료 내 Prebiotic과 Probiotics의 첨가가 참돔(Pagrus major)의 성장, 면역력, 항산화력, 장내 미생물 조성 변화에 미치는 영향

  • Jongho, Lim (Department of Marine Life sciences, Jeju National University) ;
  • Gunho, Eom (Department of Marine Life sciences, Jeju National University) ;
  • Choong Hwan, Noh (Korea Institute of Ocean Science and Technology) ;
  • Kyeong-jun, Lee (Marine Science Institute, Jeju National University)
  • 임종호 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 엄건호 (제주대학교 해양생명과학과) ;
  • 노충환 (한국해양과학기술원) ;
  • 이경준 (제주대학교 해양과학연구소)
  • Received : 2022.09.22
  • Accepted : 2023.02.08
  • Published : 2023.02.28
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Abstract

We evaluated the effects of prebiotic (mannan oligosaccharides, Mos) and probiotic diet supplements on growth performance, innate immunity, antioxidant activity, and intestinal changes in the microbial flora of red seabream Pagrus major. A basal diet (Con) was formulated to meet the nutrient requirement of red seabream. The dietary starch in Con was replaced with 0.6% Mos, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, B. licheniformis and probiotic mixture (labeled as Mos, Pro-LP, Pro-BS, Pro-BL and Pro-Mix, respectively). We stocked 450 fish in 18 polypropylene tanks (400 L) in triplicate groups per dietary treatment. The fish were fed one of the diets twice (08:30, 18:30 h) a day for 63 days. Lysozyme activity was significantly higher in all the supplemented groups than that of the Con group. The immunoglobulin level of Pro-Mix, anti-protease activity of Pro-BL, and glutathione peroxidase and superoxide dismutase activity of Pro-BS, Pro-BL and Pro-Mix groups were significantly higher than those of the Con group. The ratio of total Vibrio/heterotrophic marine bacteria counts was significantly lower in Pro-LP, Pro-BL and Pro-Mix groups than that of the Con group. Therefore, dietary supplementation of Mos and probiotics to improves immune response and antioxidant enzyme activity and inhibits Vibrio bacteria in the intestine.

Keywords

서론

양식 어류에서 prebiotics의 사용은 주로 사료를 통해 이루어지며, 장내 미생물의 성장과 조성에 영향을 주어 어류의 성장과 사료효율 및 면역력을 향상시키는 것으로 보고되었다(Yukgehnaish et al., 2020). 장에서 증식된 유용 미생물은 여러 소화효소를 생산하고 이를 통해 영양소의 소화와 흡수를 향상시킴으로써 숙주 동물의 성장과 사료효율을 개선하는 것으로 알려졌다(Ringø et al., 2016). Mannan oligosaccharides (Mos)는 Saccharomyces cerevisiae와 같은 효모류의 세포벽을 구성하는 prebiotic으로 어류 사료의 첨가제로 사용했을 경우 성장뿐만 아니라 면역력을 크게 향상시키는 것으로 최근 보고되고 있다(Dawood et al., 2020a). Magouz et al. (2021)은 사료 내 Mos의 첨가는 thinlip grey mullet Liza ramada에서 비특이적 면역력과 항산화능력을 향상시키고, 장내 유용 미생물의 번식을 용이하게 한다고 보고하였으며, Genc et al. (2007)은 hybrid tilapia Oreochromis niloticus×O. aureus의 장 융모 발달을 돕는다고 보고하였다. 그러나 참돔(Pagrus major)에서의 Mos 연구는 미흡한 실정이다. 어류의 장은 병원성 미생물에 대한 면역 반응이 가장 활발한 기관이며, 장내 미생물의 조성에 따라 면역 반응 활성이 크게 영향을 받는다고 알려져 있다(Dawood et al., 2020a). 동물의 장에는 Bacillus, Lactobacillus, Proteobacter와 같은 장 건강에 매우 유익한 미생물뿐만 아니라 Vibrio, Edwardsiella와 같은 병원성을 띄는 미생물도 같이 서식한다. Prebiotics와 probiotics는 양식생물의 장에서 유용 미생물의 성장을 돕고 병원성 미생물을 억제하여 장내 면역력을 증진시키기 위한 천연 면역 증강제로써 널리 이용되고 있다(Dawood et al., 2018). 이러한 이유로 최근 어류를 대상으로 prebiotics와 probiotics에 대한 연구는 성장뿐만 아니라 면역력과 건강도 및 장내 유용 미생물의 조성변화에 초점을 두고 이루어지고 있다(Munir et al., 2016).

Lactobacillus와 Bacillus는 양식생물의 면역력과 항산화능력을 향상시키기 위한 probiotics로써 주목받고 있다(Giri et al., 2014). 어류를 대상으로 한 사료 내 probiotics 첨가에 대한 연구는 넙치(Paralichthys olivaceus; Ye et al., 2011), 병어(Pampus argenteus; Gao et al., 2016), tilapia O. niloticus (Liu et al., 2017) 등을 대상으로 수행되었다. Tilapia (Taoka et al., 2006), 잿방어(Seriola dumerili; Dawood et al., 2015), 참돔(Dawood et al., 2016b)을 대상으로 한 연구에서 사료 내 probiotics의 첨가는 성장과 사료효율 뿐만 아니라 비특이적 면역력과 질병 저항성을 향상시킨다고 보고되었다.

참돔은 국내 주요 양식어종으로서 2021년도 국내 생산량은 8,313톤에 이르며, 그 생산량은 지속적으로 증가할 것으로 전망된다(KOSIS, 2022). 그러나 최근 양식 산업에서는 대상 생물을 주로 고밀도로 양식하기 때문에 스트레스로 인한 면역력이 저하되어 질병이 자주 발생하고, 그로 인해 경제적 피해가 증가하고 있는 실정이다(Hasan et al., 2019). 국내의 어류 양식에서는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 주로 약제나 항생제를 많이 사용한다(Kim et al., 2022). 전염성 질병을 억제하기 위한 항생제와 화학약품의 사용은 내성균의 출현, 유용 미생물의 사멸, 인체 내 축적과 같은 여러 부작용들을 유발할 수 있다(Banerjee and Ray, 2017). 따라서, 어류의 면역력과 질병 저항성을 향상시키기 위한 양식 사료 내 천연 면역증강제의 발굴과 개발이 절실히 필요하다(Dawood et al., 2018). 어류 사료 내 probiotics의 첨가 효과에 대한 연구는 대부분 치어기 어류를 대상으로 8주 미만으로 단기간 동안 수행되었으며, 260–390 g 참돔을 대상으로 수행된 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 이번 연구는 사료 내 prebiotic과 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가가 참돔의 성장과 사료효율 뿐만 아니라 비특이적 면역력, 항산화 활성, 장내 미생물 조성에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

실험사료

본 실험에 사용된 Bio-Mos (Alltech, Nicholaville, KY, USA), Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis (FNCbio CO., Ltd., Daejeon, Korea), B. licheniformis (KCCM11751P; Woogene B&G CO., Ltd., Seoul, Korea)는 국내 회사에서 구입하여 사용하였다. Probiotics의 균 농도는 1×1010 CFU (colony forming unit)/g으로 각 첨가구에 0.6%씩 첨가되었다. 대조사료는 조단백질 58.8%, 조지질 12.7%, 회분 10.8%가 되도록 조성되었다. 실험사료는 Mos를 0.6% (Mos), L. plantarum을 0.6% (Pro-LP), B. subtilis를 0.6% (Pro-BS), B. licheniformis를 0.6% (Pro-BL), Probiotics 혼합구는 3가지 probiotics를 각각 0.2%씩(Pro-Mix) 첨가하였다. Probiotics는 동결건조 상태에서 밀봉된 상태로 보관되었으며, 사료 제작 당시 개봉하였다. 실험사료는 원료를 혼합한 뒤, 어유와 증류수(15%)를 혼합하였다. 실험사료는 펠렛성형기(SP-50; Kumkang ENG, Daegu, Korea)를 이용하여 직경 5 mm 크기로 성형하였다. 실험사료는 건조(25°C, 8 h)시킨 후 사료공급 전까지 냉장보관(4°C)하였다. 실험사료의 조성은 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the experimental diets for red sea bream Pagrus major (% of dry matter)

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1Orizon S.A, Chile. 2Alltech, Kentucky, USA. 3Fnbio CO., LTD, Daejeon, Korea. 4WOOGENE B&G CO., LTD, Hwaseong, Korea. 5Mineral premix (g/kg of mixture): MgSO4·7H20, 80.0; NaH2PO4·2H2O, 370.0; KCL, 130.0; Ferric citrate, 40.0; ZnSO4·7H20, 20.0; Ca-lactate, 356.5; CuCl2, 0.2; AlCl3 .6H2O, 0.15; Na2SeO3, 0.01; MnSO4·H2O, 2.0; CoCl2·6H2O, 1.0; Starch, 0.14. 6Vitamin premix (g/kg of mixture): DL-α tocopherol acetate, 20.0; thiamin hydrochloride, 4.0; riboflavin, 4.4; pyridoxine hydrochloride, 4.0; niacin, 30.0; D-pantothenic acid hemicalcium salt, 14.5; myo-inositol, 40.0; D-biotin, 0.2; folic acid, 0.48; menadione, 0.2; retinyl acetate, 1.0; cholecalciferol, 0.05; cyanocobalamin, 0.01; Starch, 881.16. 7AlphaAqua Co., Busan, Korea. Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture.Starch in the basal diet was replaced with 0.6% Mos, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, B. licheniformis and probiotics mixture (designated as Con, Mos, Pro-LP, Pro-BS, Pro-BL and Pro-Mix, respectively).

실험어 및 사육관리

실험에 사용된 넙치는 전남 고흥군에 위치한 양식장에서 구입하여 제주대학교 해양연구소에서 예비사육 후 실험에 사용하였다. 실험어(초기평균무게, 263±3.90 g)는 총 18개의 400 L 원형 polypropylene 수조에 수조 당 25마리씩, 실험구 당 3반복으로 배치되었다. 광주기는 형광등을 이용하여 12 light: 12 dark로 유지되었다. 실험사료는 1일 2회(08:00, 18:00 h)에 걸쳐 9주간 공급하였다. 사육수는 모래여과해수를 사용하여 18 L/min 만큼 공급되었고 모든 실험수조에 용존산소(dissolved oxygen, DO) 농도 유지를 위해 에어스톤을 설치하였다. 각 수조의 DO와 수온은 Pro20 Dissolved Oxygen Instrument (YSI, Yellow Springs, OH, USA)를 이용하여 1일 1회 측정되었다. 실험기간 동안 모든 실험수조의 수온은 17.5–24.4°C, DO는 8.54–9.14 mg/L로 유지되었다.

Sampling과 분석

사육실험 종료 후, 실험어는 성장률(weight gain, WG)과 사료 효율, 일간성장률(specific growth rate, SGR)과 생존율(survival)을 측정하기 위해 24 h 절식 후 최종무게(final body weight, FBW)와 실험어의 수를 측정하였다. 무게 측정 후 사료섭취량(feed intake, FI)을 측정하여 사료계수(feed conversion ratio, FCR)와 단백질이용효율(protein efficiency ratio)을 계산하였다. FBW 측정 후, 수조 당 3마리(실험구 당 9마리)의 실험어를 무작위로 선별하여 100 ppm의 2-phenoxyethanol (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 마취시켰다. 혈액은 혈청과 혈장으로 나누었으며, 혈장은 heparin (Sigma)이 처리된 주사기로 미병부에서 채혈하여 대식세포 활성(nitro-blue tetrazolium, NBT), hemoglobin과 hematocrit 분석에 사용하였다. Hemoglobin은 5 mL의 hemoglobin reagent (Yeongdong Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)에 전혈 20 µL를 반응시킨 후 자동생화학분석기(CH 100plus; RADIM Company, Firenze, Italy)를 이용하여 측정하였다. Hematocrit은 모세관 내에 전혈을 채운 후 원심분리기(Hematospin II; Hanil Science Co., Daejeon, Korea)로 원심분리(12,000 g, 15 min)하여 측정하였다. 분석 후 혈장은 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C)하여 상층액을 분리하였다. 혈청은 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C) 후 상층액을 분리하여 면역분석에 사용되기 전까지 냉동(-80°C) 보관하였다. 전어체는 냉동(-20°C) 후, 믹서기로 분쇄하여 일반성분분석 하였다.

면역력 분석은 총 5가지 항목을 조사하였다. NBT와 myeloperoxidase (MPO) 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 방법을, lysozyme 활성은 Mohammed et al. (2018)의 방법을, immunoglobulin (Ig) 함량은 Siwicki and Anderson (1993)의 방법을, anti-protease 활성은 Ellis (1990)의 방법에 따라 분석하였다. Glutathione peroxidase (GPx) 활성은 GPx assay kit(703102; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를, superoxide dismutase (SOD) 활성은 SOD assay kit (19160; Sigma)를 사용하여 분석하였다. 혈액학적 지표는 시판 kit를 이용하여 혈액생화학분석기(CH 100plus; RADIM Company)를 통해 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase(AST), total protein, glucose, cholesterol과 triglyceride 함량을 분석하였다.

실험사료와 전어체의 일반성분조성은 AOAC (2005)의 방법에 따라 분석하였다. 수분은 상압가열건조법(125°C, 3 h), 회분은 직접회화법(550°C, 4 h), 조단백질은 자동조단백질 분석기(Kjeltec system 2300; FOSS, Hillerød, Denmark)로 분석하였고, 조지질은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치(SOX406; Hanon Group Inc, Shandong, China)로 분석되었다.

장내 미생물 조성은 Silva et al. (2013)과 Safari et al. (2020)의 방법으로 분석되었다. 실험어를 얼음물에서 5분간 마취한 뒤, 해부하여 장을 적출하여 무게를 측정하였다. 무게 측정 후, 장조직을 sodium chloride (0.9%) 용액 2 mL에 넣고 균질하였다. 균질액은 원심분리(5,000 g, 5 min, 4°C)하여 상층액을 분리한 후, 농도에 따라 희석하여 배지에 100 µL를 도말하였다. Total heterotrophic marine bacteria (THB)는 marine agar (212185; BD DifcoTM, Dickinson, ND, USA)를, lactic acid bacteria(LAB)는 lactobacilli MRS agar (288210; BD DifcoTM)를, total Vibrio bacteria (TVB)는 thiosulfate citrate bile sucrose agar (213400, BD DifcoTM, Dickinson, USA)를 사용하여 최대 72 h까지 배양(27°C)하였다. 각 THB, LAB, TVB는 3반복으로 측정하였으며, lactobacilli MRS agar와 thiosulfate citrate bile sucrose agar는 colony의 형태를 관찰하여 Vibrio spp.와 LAB가 아닌 colony를 배제하였을 때 30–300개의 colony가 관찰되는 배지의 CFU를 측정하였다.

통계학적 분석

완전확률계획법(completely randomized design)으로 실험구를 배치하였고, 모든 분석결과는 SPSS (Version 24.0; International Business Machines Co., NY, USA) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Dunkan’s HSD (P<0.05)로 비교하였다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 통계분석 하였으며, 모든 데이터는 평균값±표준편차(mean±standard deviation)로 나타내었다.

결과

참돔의 FBW은 Pro-BL구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(Table 2) (P<0.05). WG, SGR은 Mos구와 Pro-BL구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). FCR은 Mos구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다(P<0.05). FI는 첨가구와 대조구 사이에 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 전어체의 조단백, 조지질, 조회분 함량은(Table 3) 대조구와 첨가구 간에 유의적인 차이가 없었다(P>0.05).

Table 2. Growth performance and feed utilization of red sea bream Pagrus major (initial body weight, 264±3.90 g) fed the experimental diets for 9 weeks

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1Final body weight (g). 2Weght gain (%)=[final weight (g) - initial weight (g)]/final weight (g)×100. 3Specific growth rate (%)={loge [final weight (g)]-loge [initial weight (g)]}/days×100. 4Feed conversion ratio=dry feed fed (g)/wet weight gain (g). 5Protein efficiency ratio=wet weight gain (g)/total protein given (g). 6Feed intake=feed consumption (g)/number of fish. Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture. Values are mean of triplicates and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

Table 3. Whole body proximate composition of red sea bream Pagrus major (initial body weight, 264±3.90 g) fed the experimental diets for 9 weeks (%, wet basis)

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Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture. Values are mean of triplicates and presented as mean±S.D. The lack of superscript letter in the same column indicates no significant differences among treatments.

비특이적 면역력은 Table 4에 나타내었다. NBT와 MPO 활성도는 대조구와 첨가구 사이에 유의적인 차이가 없었다(P>0.05). Lysozyme 활성도는 모든 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). Ig 수준은 Pro-Mix 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). Anti-protease 활성도는 Pro-BL 단독 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). 항산화 효소 활성은 Table 5에 나타내었다. GPx와 SOD 활성도는 Pro-BS, Pro-BL, Pro-Mix 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05).

Table 4. Immune responses of red sea bream Pagrus major fed the experimental diets for 9 weeks

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1Nitro-blue tetrazolium activity (absorbance). 2Lysozyme activity (µg/mL). 3Myeloperoxidase activity (µg/mL). 4Immunoglobulin level (mg/mL). 5Anti-protease activity (% inhibition). Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter in the same column indicates no significant differences among treatments.

Table 5. Anti-oxidant enzyme activities of red sea bream Pagrus major fed the experimental diets for 9 weeks

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1GPx (Glutathione peroxidase activity)=(mU/mL). 2SOD (Superooxide dismutase activity)=(% inhibition). Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

혈액분석 결과는 Table 6에 나타내었다. Hemoglobin 농도는 Pro-BS 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). 혈장의 total protein 농도는 Pro-BL과 Pro-Mix 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). Glucose 농도는 Mos와 Pro-BS 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다(P<0.05). Hematocrit과 혈장의 AST, ALT, cholesterol, triglyceride 농도는 대조구와 첨가구 간에 유의적인 차이가 없었다(P>0.05).

Table 6. Hematological parameters of red sea bream Pagrus major fed the experimental diets for 9 weeks.

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1AST (Aspartate aminotransferase)= (U/L). 2ALT (Alanine aminotransferase)=(U/L). 3Total protein=(U/L). 4Glucose=(mg/dL). 5Cholesterol=(mg/dL). 6Triglyceride=(mg/dL). Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides;Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture. Values are mean of triplicate groups and presented as mean±S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter in the same column indicates no significant differences among treatments.

참돔의 장내 미생물 조성 분석 결과는 Fig. 1에 나타내었다. THB에 대한 LAB의 비율은 Pro-BL 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(P<0.05). THB에 대한 TVB의 비율은 Pro-LP, Pro-BL, Pro-Mix 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다(P<0.05).

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Fig. 1. Intestinal microbiota ratio of lactic acid bacteria (LAB) and total Vibrio bacteria (TVB) to total heterotrophic marine bacteria (THB) of red sea bream Pagrus major (initial body weight, 264±3.90 g) fed the experimental diets for 9 weeks. Bars with different letters are significantly different (P<0.05). Con, Control; Mos, Mannan oligosaccharides; Pro-LP, Probioitic-Lactobacillus plantarum; Pro-BS, Probiotic-Bacillus subtilis; Pro-BL, Probiotic-Bacillus licheniformis; Pro-Mix, Probiotic-mixture.

고찰

Dawood et al. (2020b) 치어기 참돔(7 g) 사료에 Mos를 첨가할 경우 소화효소의 생산과 장내 유익균의 성장을 자극하여 WG와 사료효율을 증진시킨다고 보고하였으며, Wang et al. (2019)은 probiotics의 단일 혹은 혼합 첨가는 다양한 어종의 성장을 향상시킨다고 보고하였다. 9주간의 사육실험 결과 WG와 SGR은 Mos구와 Pro-BL구가 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며 다른 첨가구도 대조구에 비해 높은 경향을 나타내었다. Mos구는 대조구에 비해 FCR이 유의적으로 낮게 나타났다. 따라서 Mos의 단독 첨가와 probiotics 단독 혹은 혼합 첨가는 참돔(260–390 g)의 성장을 증진시키며, Mos는 성장뿐만 사료효율을 증진시킬 수 있을 것으로 판단된다.

어류의 비특이적 면역체계는 병원성 미생물의 감염을 억제하기 위한 핵심적인 역할을 한다(Lieschke and Trede, 2009). 사료에 Mos 또는 probiotics의 첨가는 동물의 장내 면역반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Jang et al., 2019; Lu et al., 2019). Dawood et al. (2020b)의 연구에서는 사료 내 Mos의 첨가가 참돔의 비특이적 면역력을 향상시킨다고 보고하였다. Heo et al. (2013)은 넙치 사료에 L. lactis를 첨가하였을 때, 비특이적 면역력이 크게 향상되었다고 보고하였다. 이번 연구에서도 anti-protease와 lysozyme 활성도 및 Ig 농도는 모든 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 높거나 경향적으로 높았다. 이러한 면역력 증강 효과는 사료에 단독 첨가된 Mos와 단독 또는 혼합 첨가된 probiotics에 의해 장내 미생물 조성과 장 건강이 개선되었기 때문인 것으로 판단된다(Dimitroglou et al., 2010; Ringø et al., 2016). 이번 연구에서는 probiotics 단독 첨가구와 혼합 첨가구 사이에 면역력 향상 효과의 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. Giri et al. (2014)은 Rohu Labeo rohita 사료에 probiotics의 혼합 첨가는 단독 첨가구에 비해 어류의 비특이적 면역력을 증진시킨다고 보고하였다. 어류의 경우, 사료 내 prebiotics 또는 probiotics의 첨가는 어종, 성장 단계, 사육수온, 첨가 함량과 형태에 따라 효과가 다를 수 있다(Torrecillas et al., 2014; Yang et al., 2016). 따라서 다양한 조건에서 참돔을 대상으로 한 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가 효과에 대한 추가적인 연구가 요구된다.

어류는 SOD와 GPx와 같은 항산화효소를 통해 면역반응에서 발생하는 활성산소를 제거하여 조직의 산화스트레스를 방지한다(Cheng et al., 2015). 사료 내 prebiotics (Lu et al., 2020), Lactobacillus (Nguyen et al., 2019), Bacillus (Lee et al., 2019)의 첨가는 어류의 항산화력을 높일 수 있다고 보고하였다. 이번 연구에서도 Mos와 probiotics 첨가구에서 대조구에 비해 SOD와 GPx 활성도가 향상되었으며, 그 중에서도 Pro-BS, Pro-BL, Pro-Mix 첨가구는 SOD와 GPx 활성도 모두 대조구에 비해 유의적으로 높았다. 따라서, 사료 내 Mos의 단독 첨가와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가는 참돔의 항산화효소 활성을 강화하고 조직 내 산화스트레스를 감소시키는 효능이 있다고 사료된다.

혈액학적 지표는 어류의 건강도(hemoglobin, hematocrit), 물질 대사(total protein, cholesterol, triglyceride, glucose), 스트레스에 의한 간 손상(ALT, AST)을 판단하기 위해 이용하고 있다(Casanovas et al., 2021). 본 연구에서도 Mos와 probiotics의 첨가에 의한 참돔의 혈액 내 total protein 농도를 증진시켰다. 어류 사료 내 Mos의 단독 첨가와 L. plantarum, B. subtilis, B. licheniformis의 단독 또는 혼합 첨가는 단백질 소화율과 효소 생산을 향상시켜 혈액 내 total protein 농도를 증진시킬 수 있다고 보고되었다(Hasan et al., 2019; Magouz et al., 2021). 따라서, 사료 내 Mos의 단독 첨가와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가는 단백질 이용성을 높일 수 있다고 판단된다. 사료 내 prebiotic의 단독 첨가와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가는 어류의 건강도(Dawood et al., 2020b)와 스트레스에 대한 저항성(Dawood et al., 2015)에 부정적인 영향이 없다고 알려져 있다. 이번 연구에서 사료 내 prebiotic의 단독 첨가와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가는 참돔 혈액의 hemoglobin의 수치를 향상시키는 경향을 나타내었으며, Pro-Mix 혼합 첨가구는 대조구에 비해 유의적으로 높았다. 스트레스 지표인 AST, ALT 농도는 대조구와 첨가구 사이에 유의적인 차이가 없었다. Glucose 농도는 Pro-BL과 Pro-Mix 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다. 따라서 사료에 Mos의 단독 첨가와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가는 참돔의 건강도를 높이고 스트레스를 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다.

어류 사료에 probiotics의 첨가는 어류의 장에서 유용 미생물의 증식을 촉진하고(Ran et al., 2016) 병원성 미생물의 증식을 억제하여(Kesarcodi-Watson et al., 2008) 질병 저항성을 향상시킬 수 있다고 알려져 있다(Gobi et al., 2018). 넙치 사료에 Lactococcus와 Bacillus의 첨가는 장내 병원성 미생물의 증식을 억제한다고 보고되었다(Hasan et al., 2018a, 2018b). 이번 연구에서도 참돔 사료에 Mos와 probiotics의 첨가는 장내 미생물의 조성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 참돔의 장내 THB에 대한 LAB의 비율은 모든 첨가구에서 대조구에 비해 높았으며 이는 사료에 단독 첨가된 Mos와 단독 또는 혼합 첨가된 probiotics가 유용 미생물인 LAB의 증식을 촉진하였기 때문인 것으로 추측된다. 게다가, 참돔의 장내 THB에 대한 TVB의 비율은 Mos와 모든 probiotics 첨가구에서 감소하였다. 하지만 Pro-LP구의 경우 Pro-BL구에 비해 낮은 경향을 보였다. Probiotics는 어종, 첨가함량과 형태에 따라 효과가 달라진다(Torrecillas et al., 2014; Yang et al., 2016). 본 연구의 경우 260 g 참돔 사료 내에 probiotics를 0.6% 첨가할 경우에는 B. licheniformis가 L. plantarum보다 이용성이 높아 장내 THB에 대한 LAB의 비율이 더 높게 나타나는 것으로 판단된다. Dias et al. (2018)은 tambaqui Colossoma macropomum 사료에 B. cereus의 첨가가 병원성 미생물에 대한 저항성을 향상시켜준다고 보고하였다. Tilapia 사료에 열처리된 B. pumilus와 L. plantarum을 첨가할 경우, Aeromonas hydrophila와 S. agalactiae에 대한 저항성을 향상시킨다고 보고하였다(Aly et al., 2008; Nguyen et al., 2019). 따라서 사료에 Mos와 probiotics의 첨가는 참돔의 장에서 병원성 미생물인 Vibrio 균의 증식을 억제하여 장 건강에 긍정적인 영향을 줄 것으로 판단되며, 이러한 효능이 참돔의 질병 저항성에 끼치는 영향에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

어류 사료에 Mos (Munir et al., 2016)와 probiotics (Park et al., 2020)의 첨가는 장내 유용 미생물의 증식과 소화효소 생산을 촉진하여(Tran et al., 2017), 숙주생물의 WG와 영양소 소화율을 높이는 것으로 알려져 있다(Hisano et al., 2018). 갑각류인 보리새우(Marsupenaeus japonicus) 후기 유생 사료에 probiotics를 첨가할 경우에도 WG가 증가한다고 보고되었다(Tung et al., 2009). 본 연구에서는 사료에 Mos와 probiotics의 단독 또는 혼합 첨가가 260–390 g 참돔의 WG를 약 5%가량 향상시키는 것으로 나타났으며, Mos구와 Pro-BL구는 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. Dawood et al., (2016a, 2016b)은 치어기(2–3 g) 참돔 사료에 L. rhamnosus, L. plantarum, L. lactis를 첨가하였을 때 사료효율, 장내 LAB 수, total protein 및 선천 면역력이 유의적으로 증가하였다고 보고하였다. 따라서, 사료에 Mos와 probiotics를 적정량으로 단독 또는 혼합 첨가하면 참돔의 성장, 사료 효율, 비특이적 면역력을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.

결론적으로, 사료에 Mos와 3종의 probiotics를 적정량(약 0.6%)으로 첨가했을 때 260–390 g 참돔의 성장, 사료효율, 비특이적 면역력, 항산화효소 활성을 향상시켰다. 이는 Mos와 probiotics가 참돔의 장내 유용 미생물(LAB)의 증식을 촉진하고 병원성 미생물(Vibrio spp.)의 증식을 억제하여 참돔의 장 건강을 개선하였기 때문인 것으로 사료된다. 어류 사료에 prebiotics와 probiotics의 첨가 효과는 어류의 종, 성장 단계, 첨가함량과 형태, 양식 환경에 따라 다를 수 있기 때문에 보다 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

사사

본 연구는 “해양생물 마이크로바이옴 분석과 적용 연구를 통한 마린바이오틱스 개발” 연구의 일환으로 해양수산부의 지원을 받아 수행되었음(20210469).

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