Manifestation of Transparent-Scaled Variant Type in Rhodeus notatus

떡납줄갱이(Rhodeus notatus)의 Transparent-Scaled Variant Type 출현 보고

Abstract

This study evaluated the external form of Rhodeus notatus TSV (transparent-scaled variant) type identified in Korea for the first time and compared it with that of the normal type. The TSV units newly found on Rhodeus notatus are iii10 of dorsal fin and anal fin iii10, which are similar to that in the normal type, considering the observing coefficient of each part's fins. The external form is, transparent enough to see the red gill filament in the operculum, the spiral digestive organ is observed opaquely, and numerous melanophores are stained at the upper part of abdomen. The coloration and scales are different between TSV type and normal type; however, there is no difference in the external form and meristic character.

서 론

납자루아과(Acheilognathinae) 어류는 담수산 석패과(Union- idae) 이매패류를 숙주로 이용하는 독특한 산란습성을 가지고 있으며, 전 세계에 3속 75종이 알려져 있고(Nelson et al., 2016), 우리나라에는 3속 16종이 분포하고 있다(Chae et al., 2019). 이중 떡납줄갱이(Rhodeus notatus)는 잉어목(Cypriniformes) 납자루 아과 납줄개속(Rhodeus)에 속하는 어류로 우리나라를 비롯한 중국에도 분포하고 있으며, 유속이 완만한 하천이나 저수지의 수초가 많은 지역에 서식한다(Kim et al., 2005). 떡납줄갱이를 비롯한 납자루아과 어류는 난내 발생부터 전기자어 시기 동안을 조개 안에서 보내며 높은 생존율을 유지하도록 진화해왔으나 최근 하천정비공사, 수질오염 등으로 이매패류의 개체 수가 감소하면서 오히려 생존에 위협을 받고 있는 실정이다(Baek and Song, 2005; Kim et al., 2011). 또한 한강납줄개 (Rhodeus pseudosericeus), 임실납자루(Tanakia somjinensis), 묵납자루(Tanakia signifer), 큰줄납자루(Acheilognathus ma- jusculus) 등은 멸종위기종 2급으로 법적 보호를 받고 있는 실정이다. 이들의 종 보존과 보호에 대해 다양한 연구가 이루어지고 있는 가운데 2017년 충남 당진시에 위치한 농수로에서 체외 비늘이 소량 발달되어 있고, 아가미와 소화기관을 위주로 체색이 반투명한 형태를 띠는 떡납줄갱이를 발견하였다. 이러한 형태는 TSV (transparent scaled variant) type이라고 하며 잉어목 어류에서 자주 발견되는 것으로 보고되었다(Nakamura, 1955; Nagata et al., 1996). TSV type 어류에 대한 관련 연구로는 금붕어(Carassius auratus; Kajishima, 1977), 송사리(Ory- zias latipes; Iwamatsu, 1993), 일본산 흰줄납줄개(R. ocellatus ocellatus; Kawamura et al., 1998) 및 붕어 교잡종(Xu et al., 2015) 등에서 나타났다고 보고되었으며, 이와 유사한 알비노 어류들의 형태적 특징은 TSV type과 유사하지만 붉은 색 눈을 가진 점에서 차이를 보인다. 관련 연구로는 버들붕어(Macro- podus opercularis; Goodrich and Maurice, 1937), 제브라피쉬 (Danio rerio; Lin et al., 1992), 메다카송사리(Oryzias latipes; Koga et al., 1995), 묵납자루(Oh et al., 2010), 미꾸리(Misgur- mus anguillicaudatus; Song et al., 2017) 등이 연구되어 왔으나 이번 TSV type의 떡납줄갱이는 우리나라에서 처음 발견되었으므로 관련 연구는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 TSV type의 형태 및 유전적 특징을 분석하여 normal type (NT)과 차이를 비교하고 인공수정을 통한 번식 가능 유무를 확인하여 관상어와 같은 산업적 활용 가능성에 대하여 논의하였다.

재료 및 방법

시료확보

연구에 사용된 TSV type 개체는 2017년 충청남도 당진시 송악읍에 위치한 농수로(폭 1–1.5 m, 수심 50 cm)에서 족대(망목 4×4 mm)를 이용해 1개체를 채집하였고, 현장에서 산소 포장 후 연구실로 운반하였다(Fig. 1). 운반한 시료는 사각 유리수조 (50×35×35 cm)에서 스펀지여과기를 이용해 순환 여과 식으로 사육하였고, 배합사료(Tetramin; Tetra^®, Melle, Germany) 를 2회/일 공급하였다.

Fig. 1. Sampling area in farm waterway of Chungcheongnam-do, Dangjin-si, Songak-eup.

형태분석

외부형태 분석을 위해 MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA) 마취제를 이용하여 마취 후 Hubbs and Lagler (2004)의 측정법을 인용한 Kwak et al. (2020)의 방법을 따랐다. 총 5개의 계수 형질과 19개의 계측형질을 측정하였고, 측정항목은 등과 뒷지느러미 기조 수, 종렬비늘수, 측선비늘수, 새파수를 계수하였으며, 체장에 대한 체고, 두장, 등지느러미 기점거리, 가슴지느러미 기점거리, 뒷지느러미 기점거리, 배지느러미 기점거리, 미 병장, 미병고, 등지느러미 기저길이, 뒷지느러미 기저길이, 등지느러미 길이, 가슴지느러미 길이, 배지느러미 길이, 뒷지느러미 길이와 두장에 대한 문장, 안경, 양안간격, 미병장, 미병고를 계측하였다. 계수형질은 실체현미경(JP SMZ800; Nikon, Tokyo, Japan)으로 계수하였고, 계측형질은 Digiter caliper (Mitutoyo, Kanagawa, Japan)를 사용하였다.

유전학적 분석

유전자 분석을 위해 어류의 비늘로부터 DNA (deoxyribo- nucleic acid)를 추출하였으며, DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen Co., Germantown, MD, USA)를 이용하여 공급자에 매뉴얼에 따라 수행하였다. 추출된 DNA는 분광광도계(nano- drop)로 농도 및 순도를 측정하였다. 유전자 분석 마커로는 미토콘드리아 유전체의 CO₁ (cytochrome c oxidase subunit 1) 유전자와 핵 유전체의 RAG1 (recombination activating gene 1) 유전자 영역을 이용하였다. 프라이머는 CO₁ 유전자의 경우에는 FishF1 (5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’) 과 FishR1 (5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’) 을 사용하였으며(Ward et al., 2005), RAG1 유전자의 경우에는 RAG1F (5’-ATATTCCAGCCCCTGCACAC-3’)과 RAG1R (5’-ACATGGGCCAGAGTCTTGAG-3’)을 사용하였다(Kim et al., 2015). PCR (polymerase chain reaction) 반응 혼합물은 DiaStar™ Taq DNA polymerase (SolGent Co., Daejeon, Ko- rea)를 이용하였으며, 전체 용량 25 μL에 맞추어 17 μL의 3차 증류수에 10X Taq reaction buffer (25 mM MgCl₂ mixed) 2.5 μL, 5X Band Doctor™ 1.75 μL, 10 mM dNTP mix 0.5 μL, 10 pmol 의 프라이머 각 1 μL, DiaStar™ Taq DNA polymerase (5 U/ μL) 0.25 μL을 첨가하여 혼합하였다. 혼합된 PCR 반응 용액은 95°C에서 2분간 초기 변성 단계(initial denaturation) 후, 95°C 변성 단계(denaturation) 20초, 프라이머에 따라 53°C (프라이머 FishF1/FishR1) 또는 60°C (프라이머 GAG 1F/RAG1R)에서 프라이머 결합 단계(annealing) 40초, 72°C 신장 단계(exten- sion) 1분을 35회 반복한 뒤, 72°C에서 추가 신장(final exten- sion)을 5분간 진행하고 반응 종료 후 4°C로 유지하였다. 증폭된 PCR 산물은 자동전기영동장치(QIAxcel, Hilden, Germa- ny)를 이용하여 농도와 염기서열 단편의 길이를 대략적으로 확인하였다. 확인된 PCR 산물은 정제(purification) 과정을 거친 후 ABI 3730xl DNA analyzer를 통해 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 Geneious® 11.0.5 프로그램을 이용하여 수정 및 보완한 뒤 alignment를 수행하여 분석에 필요한 염기서열 데이터를 생성하였으며, MEGA 11 (Kumar et al., 2008) 프로그램을 통해 계통학적 분석을 수행하였다.

인공수정 실험

채집된 수컷 TSV type을 1년 동안 사육 후 산란기 이차성징인 혼인색과 추성을 띠었을 때 산란유도를 위해 사육 수조에 석패과 이매패류인 말조개(Unio douglasiae) 2마리와 NT 암컷 3마리를 함께 사육하였다. 사육환경은 수온 23–25°C (평균 24±1.0°C)를 유지해주었고, 광주기 조건은 light 12:dark 10으로 설정하였으며, 먹이는 냉동장구벌레(Bloodwarm; Hikari, Tohon-shi, Japan)을 2회/일 공급하였다. TSV type 번식 가능성 확인을 위해 cross breeding은 Kawamura et al. (1998)의 방법을 참고하였고(Fig. 2), 암컷의 산란관이 뒷지느러미 기점에 달하였을 때 멸균생리식염수(NaCl, 0.9%)가 담긴 패트리디쉬(Ø 15 cm)에 복부를 압박해 채란하였으며, 정액 또한 같은 방법으로 채정 후 인공수정 하였다. 수정란은 수정율을 파악 후 부화기 (Ziss-tumbler, ZissAQUA, Osan, Korea)에 수용하여 관리하였고, 부화함에 따라 부화율, 치어기까지 생존율을 조사하였다.

Fig. 2. Crossbreeding between NT and TSV type, TSV of Rhodeus notatus. A, NT (AA)×TSV (aa); B, F₁-NT (Aa)×TSV (aa); C, F₁- NT (Aa ♂)×F₁-NT (Aa ♀); D, F₂-TSV (aa ♂)×F₂-TSV (aa ♀). NT, Normal type; TSV, Transparent scaled variant.

결과 및 고찰

외부 형태적 특징

떡납줄갱이 TSV type의 체색은 주변 환경에 따라 체색이 변하였으며, 등과 배 쪽 가장자리가 짙은 흑색소포로 이루어진 점은 NT와 유사하였으나 배 쪽에 나타나는 반점모양의 흑색소포는 TSV type에서만 나타났다(Fig. 3). 몸이 하얗게 변하는 백색증 현상은 멜라닌 색소결핍에 의해 두가지 형태로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 표피와 망막의 멜라닌색소포 결핍인 알비노와 발생생리학적 문제로 색소침착이 감소하거나 없지만 망막은 색소침착이 이루어진 백색증 또는 루시즘(leucism)으로 구분하고 있다(Kinner et al., 1985).

Fig. 3. Lateral view of Rhodeus notatus (A, 56.0 mm) a NT and (B, 58.0 mm TL) TSV type. Scale bars=1.0 cm. TL, Total length; TSV, Transparent scaled variant.

TSV type은 입 주변에 이차성징인 추성이 형성되어 산란기 수컷의 특징을 나타냈으며, 눈에는 검은색의 색소침착이 있었는데 이러한 형태는 루시즘과 유사하였다. 이처럼 루시즘 현상은 서식지 오염 및 내교배 등이 발생 원인으로 알려져 있으나 미꾸리의 경우 포획 후 실내 사육 시 일정시간이 경과하면서 피부에 색소침착이 이루어져 백색증 현상과는 다르게 구분하였다 (Veena et al., 2014; Song et al., 2017). 이처럼 TSV type 금붕어도 성장함에 따라 근육이 두꺼워지면서 투명한 형태는 점차 사라진다고 하였으나(Chen, 1928; Xu, 2009), 이와 달리 TSV type 떡납줄갱이는 1년의 사육기간 동안에도 투명한 형태를 지속적으로 유지하는 특이점을 나타냈다. NT는 복부 아래쪽에 흑색소포가 침착되어 있었고, 눈 상단부와 입 부분이 붉은색을 띤 반면, TSV type은 아가미를 덮고 있는 주새개골(opercular) 위쪽에 붉은색의 새엽이 모두 보일 정도로 투명하였고, 복부에도 나선형의 소화관이 보일 정도로 투명하여 NT와 차이를 보였다.

NT와 TSV type의 계수형질 및 계측형질을 비교한 결과는 Table 1과 같았다. 계수형질은 등지느러미 기조 수 iii9개, 뒷지느러미 기조 수 iii10개로 같았고, 측선비늘수 TSV type 32개, NT 32–33개로 유사하였으며, 종렬비늘수 4개, 새파 수 TSV type 5개, NT 5–6개로 유사하여 계수형질에서 차이가 없었다. 계측형질은 체장에 대한 체고, 등지느러미 기점거리, 뒷지느러미 길이가 NT와 유사하였고, 체장에 대한 두장, 가슴지느러미 기점 거리, 미병장, 등지느러미 길이, 배지느러미 길이, 뒷지느러미 길이, 두장에 대한 안장이 유사하였으며, 뒷지느러미 기점 거리, 배지느러미 기점거리는 같았다. 또한 체장에 대한 미병고, 가슴지느러미 길이, 두장에 대한 비장, 양안간격, 미병장, 미 병고는 NT와 중간 값을 나타내 전체적인 계측형질 비교결과 TSV type은 비교한 NT와 유사하였다.

수정율, 부화율 및 생존율

NT (AA)의 암컷과 TSV type (aa) 수컷의 인공수정 시 수정율은 100%였고, 부화율은 75–85%였으며, 치어까지 최종 생존율은 57–71%였다. 이때 치어의 형태는 모두 normal type (Aa) 과 같았고, 성어로 성장 후 다시 F1 NT (Aa) 암컷과 TSV type (aa) 수컷을 인공수정 하였다. 수정율은 100%였고, 부화율은 60–71%였으며, 최종 생존율은 57–66%였다. 이때 치어의 형태 비율은 NT (Aa) 40–66%, TSV type (aa) 10–14%를 차지하여 NT (Aa)가 우세하였다. F1 NT (Aa)의 수컷과 암컷의 인공수정 결과 수정율 100%, 부화율 66–75%, 생존율 71–100%로 치어 형태 비율은 NT (Aa) 50–80%, TSV type (aa) 16–25%로 NT (Aa)가 우세하였다. 이후 F2 TSV type (aa) 수컷과 암컷의인공수정 결과 수정율 100%, 부화율 57–70%, 생존율 11–25% 였으며, 치어 형태는 모두 TSV type (aa)과 같았다(Table 2). 실험결과 TSV type의 생산을 위한 세대가 거듭될수록 생존율이 낮아지는 경향을 보였으며, 유전자 열성화 방지를 위해 NT (Aa)의 암컷과 수컷을 교배한다면 생존율을 높일 수 있을 것으로 생각된다.

Table 1. Comparison based on 5 meristic and 19 morphometric characters of the natural TSV type and its NT species of the Rhodeus notatus TSV, Transparent scaled variant; NT, Normal type.

유전학적 분석

자연에서 포획된 TSV type 1개체와 인공수정으로 태어난 F1 2개체를 미토콘드리아 유전체의 CO₁ 유전자와 핵 유전체의 RAG1 유전자를 이용하여 PCR을 수행한 결과 3개체 모두에서 증폭이 확인되었다. 증폭된 산물을 시퀀싱한 결과 미토콘드리아 유전체의 CO₁ 유전자는 620 bp, 핵 유전체의 RAG1 유전자는 839 bp 길이의 유전자 염기서열이 확인되었다. TSV type 3개체의 염기서열은 서로 비교분석 한 결과 변이 구간이 없었으며, 100% 동일한 유전자 서열로 확인되었다. NCBI에 등록되어 있는 Rhodeus속의 CO₁ 염기서열 23개와 RAG1 염기서열 26개를 다운로드하여 본 연구 결과와 비교하여 종간 차이를 분석하였다. TSV type 3개체와 NCBI의 Genus Rhodeus 23 개의 CO₁ 염기서열과 비교한 결과, TSV type 3개체는 NCBI에 등록되어 있는 떡납줄갱이와 염기서열이 100% 일치하였고, Rhodeus속 다른 종의 염기서열과는 0.1–9.7%의 차이를 나타내었다. 또한 TSV type 3개체와 NCBI의 Rhodeus속 26개의 RAG1 염기서열과 비교한 결과, NCBI에 등록되어 있는 떡납줄갱이와 염기서열이 100% 일치하였고, 다른 종과는 0.1–3% 이상 유전적 차이가 나타나 CO₁ 유전자의 결과와 유사한 경향성을 보였다. CO₁ 및 RAG1 유전자 분석 결과를 바탕으로 TSV type 3개체의 유전적 종 동정과 잡종 여부를 확인하였다. COI 및 RAG1 유전자를 이용한 계통수 분석 결과 bootstrap value 94 이상으로 TSV type 3개체가 모두 떡납줄갱이와 같은 그룹을 이루어 동일종으로 확인되었다(Fig. 4, Fig. 5). 최근 Rhodeus속은 자연잡종에 대한 보고가 많이 되고 있으며 이를 RAG1유전자 분석을 통해 잡종 여부를 판단하는데, Kim et al. (2015)에 의하면 RAG-1 유전자의 peak를 분석한 결과 명확한 single peak가 나타나면 순수한 개체, 염기 치환이 관찰되어 2 개의 염기서열로 보이는 double peak가 나타나면 잡종으로 판단하였다. 본 연구에서도 TSV type 3개체가 잡종에 의한 변이 유무 확인을 위해 RAG1 유전자로 TSV type 3개체의 염기서열을 서로 비교분석 한 결과 Kim et al. (2015)이 보고한 유의미한 double peak 변이 구간은 관찰되지 않아 잡종 가능성은 낮은 것으로 확인되었다(Fig. 6).

Fig. 4. Neighbor-Joining phylogenetic tree based on the partial sequences of the mitochondrial cytochrome c oxydase subunit 1 (CO₁) gene of three Rhodeus notatus TSV type. The evolutionary distances were computed using the maximum composite likelihood method. TSV, Transparent scaled variant.

Table 2. Results in crossbreeding between NT and TSV of Rhodeus notatus, as shown in Fig. 2

NT, Nomal type; TSV, Transparent scaled variant.

Fig. 5. Neighbor-Joining phylogenetic tree based on the partial sequences of the nuclear recombination activating gene 1 (RAG1) gene of three Rhodeus notatus TSV type. The evolutionary distances were computed using the maximum composite likelihood method. TSV, Transparent scaled variant.

Fig. 6. The peak analysis of lag1 gene from three TSV type individuals. TSV, Transparent scaled variant.

산업적 활용 가능성

TSV type 어류의 산업적 활용은 주로 관상어를 대상으로 주목받고 있으며, 일본의 납자루아과 어류에서는 TSV type 2개 품종 외에도 10개의 품종개발에 성공하였다(Akai et al., 2011). 또한 TSV type의 일본산 흰줄납줄개 R. ocellatus kurumeus는교배를 통한 재생산 연구도 이루어져 다양한 관상어 품종개발의 가능성을 보여주고 있다(Kawamura et al., 1998).

2018년 기준 전 세계 관상어 교역액은 629백만달러(약 6,841억원), 국내에서는 2019년 기준 4, 874억원 정도로 관상어 사육문화가 증가하면서 점차 산업의 규모가 확대되고 있으며(MOF, 2020), 수입되는 열대어 대부분은 각 나라의 민물고기를 채집 또는 양식하여 들여오고 있으나 한반도에 서식하고 223종의 민물고기 가운데 관상어로 각광받고 있는 몇몇 종들이 매니아 층에게 알려져 있을 뿐 대중적으로 잘 알려지지 않은 실정이다.

일본에서는 TSV type의 납자루아과 어류를 관상어로 사육하는 매니아층이 있는 것으로 알려져 우리 주변에서 쉽게 볼 수 없는 이색적인 형태를 지녔다는 점에서 각광을 받을 것으로 보인다. 떡납줄갱이 TSV type과 마찬가지로 많은 사람들이 관심을 가지고 새로운 품종이 개발된다면 우리나라 민물고기를 대상으로 한 관상어의 가치와 산업적 활용 가능성은 더욱 커질 것으로 생각된다.